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【關(guān)鍵詞】 川芎嗪注射液; 腹膜間皮細(xì)胞; 高糖; ⅰ型膠原; 基質(zhì)金屬蛋白酶?1; 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑?1; 體外實驗
zhu gs, he js. j chin integr med. 2009; 7(1): 65?69.
received june 18, 2008; accepted july 22, 2008; published online january 15, 2009.
indexed/abstracted in and full text link?out at pubmed. journal title in pubmed: zhong xi yi jie he xue bao.
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doi: 10.3736/jcim20090110open access
effects of ligustrazine injection on high glucose?induced type ⅰ collagen, matrix metalloproteinase?1 and tissue inhibitor of metalloproteinase?1 expressions in human peritoneal mesothelial cells in vitro
gui?song zhu, jin?song he
department of nephrology, the affiliated drum tower hospital, nanjing university medical school, nanjing, jiangsu province 210008, china
objective: to investigate the effects of ligustrazine injection on type ⅰ collagen, matrix metalloproteinase?1 (mmp?1) and tissue inhibitor of metalloproteinase?1 (timp?1) expressions in human peritoneal mesothelial cells (hpmcs) cultured in high glucose conditions.
methods: hpmcs were isolated from human omenta by trypsin digestion method and subcultured. then, the hpmcs were divided into normal control group, high glucose group and high glucose plus low?, medium? and high?dose ligustrazine (10, 20 and 40 mg/l ligustrazine respectively) groups. semi?quantitative reverse transcription?polymerase chain reaction was used to detect the expressions of type ⅰ collagen, mmp?1 and timp?1 mrnas in hpmcs. proteins of type ⅰ collagen, mmp?1 and timp?1 in culture supernatants were measured by enzyme?linked immunosorbent assay (elisa). cell protein concentration was measured by trace bicinchoninic acid method to correct the elisa assay results.
results: ligustrazine injection could significantly decrease high glucose?induced type ⅰ collagen and timp?1 expressions in a dose?dependent manner both in protein and gene levels (p<0.05, p<0.01). in addition, medium? and high?dose ligustrazine injection could significantly increase mmp?1 expression which was inhibited by high glucose concentrations (p<0.05).
conclusion: ligustrazine injection does not only decrease type ⅰ collagen synthesis, but also promote its degradation by modulating unbalanced mmp?1/timp?1 expression in hpmcs cultured in high glucose conditions.
keywords: ligustrazine injection; human peritoneal mesothelial cells; high glucose; type ⅰ collagen; matrix metalloproteinase?1; tissue inhibitor of metalloproteinase?1; in vitro
腹膜纖維化是腹膜透析治療的主要并發(fā)癥,最終導(dǎo)致腹膜功能衰竭,這是腹膜透析患者退出治療的主要原因[1]。腹膜纖維化以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ecm)的過度沉積為特點[2]。研究表明,ecm的過度沉積是由于ecm合成與降解失衡而引起[3]。ⅰ型膠原是腹膜纖維化中主要的ecm[4],其降解過程受基質(zhì)金屬蛋白酶?1(matrix metalloproteinase?1, mmp?1)及其特異性抑制劑金屬蛋白酶組織抑制劑?1(tissue inhibitor of metalloproteinase?1, timp?1)調(diào)控[5]。有研究證實,高糖能上調(diào)腹膜間皮細(xì)胞(human peritoneal mesothelial cells, hpmcs)ⅰ型膠原和timp?1的表達(dá),降低mmp?1活性[3]。本研究通過觀察川芎嗪注射液對高糖刺激下hpmcs ⅰ型膠原、mmp?1和timp?1表達(dá)的影響,探討川芎嗪在防治腹膜纖維化中的作用及其機制。
1 材料和方法
1.1 試劑和主要儀器 川芎嗪注射液(江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,批準(zhǔn)號為國藥準(zhǔn)字h20020630);50%葡萄糖注射液(江蘇方強制藥廠,批號為200710111)。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, pbs)、胎牛血清(fetal calf serum, fcs)、trizol和rpmi?1640粉劑等(gibco公司);胰蛋白酶和瓊脂糖粉等(promega公司);ⅰ型膠原、mmp?1和timp?1酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme?linked immunosorbent assay, elisa)試劑盒(adl公司);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, bca)蛋白含量檢測試劑盒(南京凱基生物科技公司);ⅰ型膠原、mmp?1、timp?1和β?actin引物,m?mlv第一鏈cdna合成試劑盒和taq酶等(invitrogen公司);抗細(xì)胞角蛋白抗體、抗細(xì)胞波形蛋白抗體、第ⅷ因子抗體和抗白細(xì)胞cd45抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)。nu?2500e二氧化碳培養(yǎng)箱(nuaire公司);全自動酶標(biāo)儀(biobank公司);生物電泳圖像分析系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1 hpmcs的培養(yǎng)與鑒定 取來自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院普外科擇期腹部手術(shù)患者(排除尿毒癥、腹膜炎)捐獻(xiàn)的大網(wǎng)膜組織,按文獻(xiàn)[3]方法原代培養(yǎng)hpmcs,按1?3傳代,第3代細(xì)胞用于實驗,每次實驗均由來自3個患者的標(biāo)本進(jìn)行3次獨立實驗。倒置相差顯微鏡觀察hpmcs呈多邊形,似鋪路鵝卵石樣外觀;免疫組化鑒定抗細(xì)胞角蛋白抗體和抗波形蛋白抗體染色陽性,抗第ⅷ因子抗體和抗白細(xì)胞cd45抗體染色陰性。
1.2.2 實驗步驟和分組 hpmcs用含1%fcs的rpmi?1640培養(yǎng)液同步培養(yǎng)24 h后分為5組(每組設(shè)3個樣本):正常組(完全培養(yǎng)液)、高糖對照組(2.5%葡萄糖)和高糖(2.5%葡萄糖)加低、中、高劑量川芎嗪(10、20和40 mg/l)組。各組完全培養(yǎng)液均為含有15% fcs的rpmi?1640培養(yǎng)液。細(xì)胞置于37 ℃、5% co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。
1.2.3 elisa法檢測細(xì)胞上清液中ⅰ型膠原、mmp?1和timp?1含量 分組干預(yù)48 h后,離心收集上清液,按elisa試劑盒說明書檢測ⅰ型膠原、mmp?1和timp?1表達(dá)水平。用0.1 mol/l naoh溶解細(xì)胞沉淀,bca蛋白檢測試劑盒測定細(xì)胞沉淀中蛋白質(zhì)濃度,用相應(yīng)蛋白質(zhì)濃度結(jié)果校正檢測結(jié)果。
1.2.4 半定量rt?pcr 分組處理同上。采用trizol一步法提取總rna,2 μg總rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna,50 μl反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴增,以β?actin作內(nèi)參照(引物序列及反應(yīng)條件見表1)。1.5%瓊脂糖凝膠電泳(110 v,15 min)進(jìn)行pcr產(chǎn)物鑒定,電泳圖像分析儀掃描分析,mrna相對含量用其pcr產(chǎn)物吸光值(absorance, a)與β?actin a值的比值表示。引物及pcr反應(yīng)條件見表1。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)用x±s表示,采用spss 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,組間差異比較采用單因素方差分析,兩組間均數(shù)比較采用lsd?t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。 表1 ⅰ型膠原、mmp?1、timp?1和β?actin引物序列及pcr反應(yīng)條件
2 結(jié) 果
2.1 上清液中ⅰ型膠原、mmp?1和timp?1蛋白質(zhì)水平 與正常組比較,高糖對照組上清液中ⅰ型膠原和timp?1含量顯著升高(p<0.01),mmp?1含量顯著下降(p<0.01);與高糖對照組比較,低、中和高劑量川芎嗪組上清液中的ⅰ型膠原和timp?1含量顯著降低(p<0.05, p<0.01),且兩者均呈量效關(guān)系,中、高劑量川芎嗪組上清液mmp?1含量顯著增加(p<0.01)。見表2。表2 各組上清液中ⅰ型膠原、mmp?1和timp?1蛋白質(zhì)表達(dá)
2.2 hpmcsⅰ型膠原、mmp?1和timp?1 mrna的表達(dá) 與正常組比較,高糖對照組hpmcs ⅰ型膠原/β?actin mrna和timp?1/β?actin mrna分別上升(15.43±0.83)倍和(4.19±0.09)倍(p<0.01),mmp?1/β?actin mrna下降(86.9±0.44)%(p<0.01);與高糖對照組相比,低、中、高劑量川芎嗪組ⅰ型膠原/β?actin mrna和timp?1/β?actin mrna表達(dá)水平均顯著下調(diào)(p<0.05),兩者均呈量效關(guān)系,中、高劑量川芎嗪組mmp?1/β?actin mrna表達(dá)顯著增加(p<0.05)。見圖1和圖2。
3 討 論
高糖透析液導(dǎo)致ecm過度沉積是腹膜纖維化的病理基礎(chǔ)[2],研究表明,高糖不僅增加hpmcsⅰ型膠原的表達(dá),并且引起ⅰ型膠原降解酶系mmp?1/timp?1的表達(dá)失衡[3]。我們的研究結(jié)果與之基本相同,此外我們發(fā)現(xiàn),川芎嗪能顯著對抗高糖的上述作用。
在生理條件下,hpmcs可以產(chǎn)生一定量的ecm和mmps/timps[3, 6]。mmps是降解ecm的蛋白水解酶系,幾乎能降解全部ecm成分。timps是內(nèi)源性分泌蛋白,作為mmps的特異性抑制因子,其n'端可與相應(yīng)的mmps催化活性中心的鋅離子結(jié)合而抑制其催化活性[7]。本實驗通過研究川芎嗪對hpmcs在高糖刺激下主要ecm ⅰ型膠原及其降解酶系mmp?1/timp?1分泌及表達(dá)的影響,旨在探討川芎嗪對hpmcs在高糖環(huán)境下ⅰ型膠原的合成和降解的干預(yù)作用及其機制。結(jié)果顯示,川芎嗪能顯著降低高糖所致的ⅰ型膠原的過度合成,同時顯著下調(diào)timp?1的表達(dá),增加mmp?1的表達(dá),提示川芎嗪亦能通過調(diào)節(jié)mmp?1/timp?1的平衡,從而促進(jìn)ⅰ型膠原的降解,減少ecm沉積。由此我們推測,川芎嗪可能具有預(yù)防或延緩腹膜纖維化的作用。
川芎嗪是中藥川芎的有效成分之一,屬酰胺類生物堿,具有活血化瘀的功效。藥理實驗證明,川芎嗪具有擴張血管、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫和鈣離子拮抗的作用[8]。目前川芎嗪抑制ⅰ型膠原、timp?1和增加mmp?1表達(dá)的機制尚不清楚。以往的研究發(fā)現(xiàn)這可能與抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長因子β1(transforming growth factor?β1, tgf?β1)表達(dá)有關(guān)[9, 10]。tgf?β1是重要的致纖維化細(xì)胞因子,參與了腹膜纖維化的病理過程[2]。tgf?β1可增加ⅰ型膠原的合成,并且抑制mmps的活性而激活timps,使ⅰ型膠原降解減少[3, 11]。有研究報道,川芎嗪能降低多種細(xì)胞如心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的膠原合成和timp?1表達(dá),而增加mmp?1的分泌和表達(dá),進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)這可能是通過抑制tgf?β/smads信號傳導(dǎo)通路繼而抑制tgf?β1表達(dá)的結(jié)果[9, 10, 12]。我們前期研究證實,川芎嗪能下調(diào)高糖致hpmcs tgf?β1的表達(dá)(文章待發(fā)表)。因此我們推測,川芎嗪抑制tgf?β1的表達(dá)可能是其抑制hpmcs ⅰ型膠原合成和調(diào)整mmp?1/timp?1表達(dá)平衡的機制之一,其具體機制將是我們下一步要研究的內(nèi)容。
綜上所述,川芎嗪能抑制高糖致hpmcs ⅰ型膠原的過度合成,并且通過調(diào)節(jié)mmp?1/timp?1的平衡,促進(jìn)ⅰ型膠原降解,從而減少ecm的沉積,防止腹膜纖維化的發(fā)生和發(fā)展。因此,川芎嗪可能具有預(yù)防或延緩腹膜纖維化的作用,這對腹膜纖維化的機制及其防治的研究有一定借鑒和應(yīng)用價值。
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教師簡短述職報告范文時間過的真快,轉(zhuǎn)眼有一學(xué)年過去了。驀然回首,往事歷歷在目。為今后更好的工作,現(xiàn)將本學(xué)期的工作述職如下:
一、錘煉業(yè)務(wù)
本學(xué)年我擔(dān)任五年級五個班的英語教學(xué)工作。在教學(xué)方面,首先按常規(guī)做好課前備課,認(rèn)真鉆研教材,努力創(chuàng)設(shè)適合高年級教學(xué)的活動形式,以激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣,誘發(fā)學(xué)生的認(rèn)知需求和創(chuàng)新欲望,使學(xué)生從情感、思維和行為上主動參與到學(xué)習(xí)中。教學(xué)中嘗試進(jìn)行語音滲透,課下組建興趣小組,拓展語音知識,培養(yǎng)學(xué)生的自學(xué)能力。輔導(dǎo)的學(xué)生,參加淄博賽區(qū)希望之星英語風(fēng)采大賽獲得一二三等獎。
課后,認(rèn)真批改學(xué)生作業(yè),對作業(yè)嚴(yán)格要求,對學(xué)生做錯的題,做到及時糾正。在家庭作業(yè)方面,采用教師,家長,學(xué)生三者評價相結(jié)合的方式,達(dá)到學(xué)生作業(yè)有人看,學(xué)生作業(yè)天天查的目的,督促學(xué)生完成課文預(yù)習(xí)、復(fù)習(xí)這一環(huán)節(jié),努力培養(yǎng)學(xué)生良好的學(xué)習(xí)習(xí)慣,并為高效學(xué)習(xí)新知識打下基矗
二、虛心學(xué)習(xí)
作為一名新教師,我在教育教學(xué)中遇到了眾多問題。問題的解決需要細(xì)心的請教,勤奮地讀書、不斷地反思和不斷否定自我,超越自我。一年來,我通讀了《生命教育-一位小學(xué)英語教師的教育生活》、《第五項修煉》《班主任工作漫談》等教育專著。另外,通過向指導(dǎo)老師請教,聽課,外出學(xué)習(xí)等,開拓自己的思維,汲取別人的優(yōu)點,不斷的完善自己的教學(xué)。并在本年度取得了些許成績,在老師們的幫助下,我擔(dān)任了張店區(qū)小學(xué)英語五年級教材備課會主講并執(zhí)教研討課一節(jié),參加區(qū)英語優(yōu)質(zhì)課比賽,區(qū)小學(xué)英語學(xué)科課堂教學(xué)實錄與評析比賽,全國第四屆新標(biāo)準(zhǔn)杯英語教案課件大賽中均獲一等獎。
古人云:飛瀑之下,必有深潭。這深潭是飛瀑長年累月沖擊地面而成的。同樣,教學(xué)經(jīng)驗和方法也是靠長時間積累起來的。在以后的教學(xué)中我還要注意對自己的知識進(jìn)行分類、比較、歸納和提煉,總結(jié)了教學(xué)中的成功與失敗、經(jīng)驗與教訓(xùn),更注重研究如何啟迪學(xué)生智慧,調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性,真正做到揚長避短,更好地教書育人。
三、勤奮工作
作為一名青年黨員教師,我時刻牢記黨旗下的誓言,保持一顆平常心,力求做到無欲而剛,遵守教師職業(yè)道德,積極參加學(xué)校組織的政治學(xué)習(xí),業(yè)務(wù)學(xué)習(xí),并記好學(xué)習(xí)筆記,心得體會,參加學(xué)校組織的各項活動。工作中,不計較個人得失,吃苦在前,做事在前,輔助大隊輔導(dǎo)員的做好各項工作,參與校報??木帉?。在這一年中,我做到了不遲到,不曠課,不早退,嚴(yán)格遵守學(xué)校的一切規(guī)章制度,課時足,滿工作量,圓滿地完成了本學(xué)年的各項任務(wù)。
回顧一年來的工作 ,有成績也有不足。我知道,任何事情都是在不斷的反思--改進(jìn)--再反思--再改進(jìn)的過程中不斷的發(fā)展進(jìn)步的,我相信在領(lǐng)導(dǎo)和同事的幫助下,我能不斷地加以克服缺點,我也將一如既往地盡自己最大的努力,為學(xué)校的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。
總之,在本學(xué)年度教育教學(xué)工作中,我與全體同事共同努力,為我校教育教學(xué)任務(wù)的完成,特別是我校語文教學(xué)水平的提高,作出了自己應(yīng)有的貢獻(xiàn),取得了一點成績。同時,自身肯定有諸多不足之處存在,逝者不可追,來者猶可鑒,在今后的工作中我將,繼續(xù)努力。
教師簡短述職報告范文時光飛逝,轉(zhuǎn)眼間,一年又過去了,在這一年當(dāng)中,我擔(dān)任著現(xiàn) 五(1)班的數(shù)學(xué)教學(xué),在這當(dāng)中我認(rèn)真做好自己的本職工作,在平凡的崗位上默默付出著,收獲著。現(xiàn)就將一學(xué)年的工作總結(jié)如下:
一、政治思想方面:
首先在師德上嚴(yán)格要求自己,認(rèn)真學(xué)習(xí)和領(lǐng)會黨的十精神,與時俱進(jìn),愛崗敬業(yè),為人師表,熱愛、尊重學(xué)生。并積極參加各種學(xué)習(xí)培訓(xùn),為了提高自己的思想覺悟,每周認(rèn)真進(jìn)行政治、業(yè)務(wù)學(xué)習(xí),并做好學(xué)習(xí)筆記。我還深知要教育好學(xué)生,教師必須先以身作則,時時做到教書育人,言傳身教,以自己的人格、行為去感染學(xué)生。并在不斷地學(xué)習(xí)中,努力使自己的思想覺悟、理論水平、業(yè)務(wù)能力都得到較快的提高。
二、教育教學(xué)方面:
加強學(xué)生的思想品德教育,使學(xué)生全面發(fā)展是教師的首要任務(wù)。我充分利用數(shù)學(xué)課,科學(xué)課有針對性在開展一些活動,提高學(xué)生的思想品德素質(zhì)。用“小學(xué)生守則”、“日常行為規(guī)范”嚴(yán)格要求學(xué)生,規(guī)范學(xué)生言行,提高全班學(xué)生的思想素質(zhì),促進(jìn)了正確班風(fēng)、學(xué)風(fēng)的形成。
實施素質(zhì)教育首要問題是面向全體學(xué)生,使每個學(xué)生的素質(zhì)都得到提高。教師必須關(guān)注班中的每一名學(xué)生,調(diào)動他們的積極性。用同一個標(biāo)準(zhǔn)去衡量全體學(xué)生是不科學(xué)的?;谶@種認(rèn)識,為了使班中每一個學(xué)生獲得不同程度的發(fā)展,我在班中開展“自己與自己比”的教育活動。在全面了解學(xué)生的思想狀況,學(xué)生基礎(chǔ),智力狀況,身體素質(zhì),性格愛好的基礎(chǔ)上,確定每一個學(xué)生的奮斗目標(biāo),同時,要求每一個學(xué)生都客觀地、全面地總結(jié)自己過去,充分認(rèn)識自我,然后在思想、學(xué)習(xí)、紀(jì)律、文體勞動、愛好特長等方面確定今后的奮斗目標(biāo),并堅持每月小結(jié)一次。
在班級學(xué)生轉(zhuǎn)化工作中,要抓得準(zhǔn),做得細(xì),有恒心,樂于幫助。我善于抓住學(xué)生學(xué)習(xí)、勞動、班級活動中閃現(xiàn)的亮點,激發(fā)他們的上進(jìn)心和求知欲。在課堂上,對于一些預(yù)知的疑難問題,師生共議解決后,我還特別叫他們起來復(fù)述,進(jìn)行難點突破、鞏固。而課堂上沒解決的,再進(jìn)行個別補習(xí)。由于長期如此,有些學(xué)生樂意配合老師的行動,他們學(xué)習(xí)也在慢慢地進(jìn)步。讓學(xué)生教育學(xué)生。有些事情在大人看來是錯誤的,但在孩子眼里卻是真實和正確的。大人教育孩子時,總喜歡擺大道理,大談自己的想法和體會,沒有觸動孩子的心理,讓孩子教育孩子的方法很有效。我在課堂中開展“我是課堂小主人”的活動,讓每個學(xué)生參與到課堂的管理中來,更好地促進(jìn)課堂的發(fā)展,看到班級存在的問題和優(yōu)勢,為班級的發(fā)展出一份力。因此,班級的習(xí)慣有了好轉(zhuǎn),學(xué)生自我管理的能力有了提高。
在教學(xué)上,為了有效地提高教學(xué)質(zhì)量,我首先從自己做起,改變觀念,努力改進(jìn)課堂教學(xué), 認(rèn)真?zhèn)浜谜n,做好課前準(zhǔn)備,上好每一節(jié)課。注意培養(yǎng)良好的學(xué)習(xí)習(xí)慣,提高學(xué)生的自學(xué)能力。沒有良好的學(xué)習(xí)習(xí)慣,學(xué)習(xí)談不上自覺學(xué)習(xí),抓學(xué)生堅持預(yù)習(xí)的習(xí)慣,學(xué)生借助課后思考題,使用工具書,查閱資料,掃清學(xué)習(xí)上的障礙,做到勤檢查。培養(yǎng)書寫規(guī)范工整的習(xí)慣,和訂正作業(yè)的習(xí)慣。優(yōu)化教學(xué)方法,充分發(fā)揮學(xué)生的主體作用。課堂上,想方設(shè)法讓學(xué)生通過眼、手、口、腦各種活動,獲得學(xué)習(xí)的樂趣,培養(yǎng)健康的個性。在老師的指導(dǎo)下,讓學(xué)生自讀、自悟、自得。重視讓學(xué)生默讀,讓學(xué)生在讀中思考,從而培養(yǎng)學(xué)生讀書的習(xí)慣和情趣。要求學(xué)生學(xué)會學(xué)習(xí)。在學(xué)習(xí)過程中,強調(diào)學(xué)生本身積極參與、吸收,成為教學(xué)活動中的主人。
另外,我積極參加教學(xué)教研活動,與同年級的老師進(jìn)行教學(xué)的研討,認(rèn)真參加學(xué)校組織的公開課觀摩活動。堅持平時的聽課學(xué)習(xí)活動,積累自己的教學(xué)經(jīng)驗,向最前沿的教學(xué)理念學(xué)習(xí)。
三、工作考勤方面:
我尊重自己所從事的事業(yè),因為每一個孩子的身上都牽系著一個家庭的希望,所以在每一天的工作時間內(nèi)都能按時作息,并積極運用有效的時間做好自己份內(nèi)的工作。有急需處理的個人事務(wù)時也能做到按規(guī)定請假。