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關鍵詞: 遺傳學課程 “創(chuàng)新型靈活教學模式” 教改
遺傳學是生命科學中進展最快和最為活躍的學科之一,已成為現(xiàn)代生命科學的共同語言和新世紀生命科學研究的前沿領域。該學科理論與技術的迅猛發(fā)展,極大地推動了整個生命科學的發(fā)展和人類進步。遺傳學課程是高校生物科學、生物技術專業(yè)一門重要的專業(yè)課程之一,如何在課程教學中既注重經典遺傳理論,又及時穿插本學科最新的研究進展,同時注重提高學生的綜合素質,增強教學效果,這是高校遺傳學教學工作者共同面對的問題。幾年來,圍繞培養(yǎng)應用型、創(chuàng)新型人才的辦學宗旨,我院遺傳學課程組教師積極進行教學改革,研究探索的“創(chuàng)新型靈活教學模式”在實際教學工作中取得了良好的教學效果。
1.精選、優(yōu)化課程內容
適應培養(yǎng)應用型人才的需要,我院制訂的新教學方案強化了實踐環(huán)節(jié),相應縮減了理論教學課時。同時由于遺傳學的飛速發(fā)展,新概念、新理論、新成就不斷涌現(xiàn),知識內容不斷增加,因而,要想在有限的學時內把課程的精華系統(tǒng)地傳授給學生,就必須首先整合課程體系,精選、優(yōu)化課程內容,合理處理基礎知識與學科前沿知識的比例關系,突出教學重點。同時還要注意遺傳學與各相關學科教學內容的銜接和縱橫聯(lián)系,避免重復?;谝陨侠砟?,我們略去了教材中遺傳的細胞學基礎、核酸的分子結構及基因的調控等與其他學科重復、交叉的內容,并將經典遺傳學的內容精簡,增加了端粒的結構與功能、表觀遺傳學等內容,從而使遺傳學課程體系更加科學、完備。
2.貫穿創(chuàng)新理念,采用靈活多樣的教學方法
“創(chuàng)新”,一方面要求教師在教學過程中始終奉行 “教師為主導,學生為主體”的理念,改變教師 “注入式”的教學模式,在教學方法的改革上與時俱進,構建全方位、多角度的師生互動研究型教學模式,并不斷發(fā)展創(chuàng)新。另一方面在教學過程中時刻注意教會學生學習,著重培養(yǎng)學生的創(chuàng)新意識和創(chuàng)新技能。
“靈活”要求教師在教學方法上不采用單一的模式,而是根據(jù)具體教學內容,靈活地應用多種教學方法,包括講授法、自學法、討論法、歸納法、比較法、推理法、抽象概括法等。如:采用課前預習促使學生帶著問題進課堂;連鎖交換規(guī)律中的交換值與基因之間距離、連鎖強度及與交換的性母細胞數(shù)之間的關系,交換值與重組值的區(qū)別,三點測驗中雙交換與干涉及并發(fā)系數(shù)之間的關系等內容,采用課堂討論式教學調動學生積極參與教學過程,加強師生互動,激活學生高級認知的能力參與學習活動,使學生對新概念、新知識的掌握通過高水平的思維加工來達成,而不再依賴過多的機械記憶,有效增強教學效果;三大遺傳規(guī)律的教學主要是采用啟發(fā)式教學方法,引導學生深刻體會遺傳學家的研究思路和技術路線及研究方法、研究結果和經驗教訓等,讓學生有置身于科研實戰(zhàn)環(huán)境的感覺,學會進行科學研究的基本方法,同時引導學生總結、歸納自由組合及連鎖交換規(guī)律的實質,調動學生學習的主動性,培養(yǎng)學生的創(chuàng)新能力和創(chuàng)造性思維能力;基因顯性的表現(xiàn)形式、伴X顯隱性遺傳及廣義和狹義遺傳力等內容,通過采用比較、啟發(fā)等多種方法,啟發(fā)學生思維,化難為易,促進學生對知識的理解和掌握,培養(yǎng)學生的創(chuàng)新精神及分析、解決科學問題的能力;根據(jù)課堂教學實際,適當布置課后練習,使基礎題突出代表性,能力題突出綜合性,并定期開展課外習題輔導,培養(yǎng)學生理論聯(lián)系實際、靈活應用知識的能力。
3.緊跟學科前沿,啟發(fā)學生的創(chuàng)新思維
隨著21世紀生命科學的飛速發(fā)展,遺傳學研究前沿不斷拓寬和深入,因而遺傳學的教學也面臨新的挑戰(zhàn),首要的問題就是知識的更新。在遺傳學教學中,要隨時注意結合最新的研究進展,把學生的思維引導到研究前沿,從而營造一種微妙、溫馨,令人產生創(chuàng)新沖動的課堂氛圍,鼓勵學生運用已有的知識和技能去想象、推測、討論,并在課后積極主動地跟蹤、查閱新知識,極大地啟發(fā)學生的創(chuàng)新思維?;钴S的課堂氣氛也能夠感染每一位學生,從而輕松實現(xiàn)教學相長。
除此之外,我們要求教師將教學、科研成果隨時融入課堂教學,充分利用教師的科研實力,拓展學生專業(yè)知識領域,強化學生綜合素質的培養(yǎng),體現(xiàn)教學、科研成果在教學中的應用,促進教學質量的提高。針對遺傳學的研究熱點,給學生提供一些信息,指導他們通過圖書館和網絡,選擇與課程內容相關的專題研究,補充課堂之所學。在此過程中使學生培養(yǎng)興趣、開闊眼界,學會主動獲取知識、應用知識和解決問題,以培養(yǎng)學生研究性學習的興趣和能力,引導學生的發(fā)散思維,增強學生參與知識建構的積極性和自覺性,培養(yǎng)學生的思維能力、觀察能力和運用能力。主講教師以電子郵箱或QQ群作為師生交流的平臺,及時最新教學材料和通知,并解答學生的疑難問題。同時,配備青年教師為課程助教,在課程主講教師指導下負責學生習題 、課外輔導、課程網站建設及參與組織各項實踐教學活動,綜合運用教學團隊的力量,更好地實現(xiàn)本課程的教學目標。
4.強化實驗教學,改革實驗考核方式
強化實驗教學有助于開發(fā)學生的潛能,培養(yǎng)學生的動手能力和創(chuàng)新能力。因此,要培養(yǎng)實踐能力強的應用型人才,首先要重點突出人才培養(yǎng)方案的實踐性。為此,我們整體優(yōu)化了實驗教學內容,精選基礎性實驗,革新驗證性實驗,拓展綜合性、分析性、探索性和創(chuàng)新性實驗。在完成基礎實驗的同時,將一些實驗內容綜合,并增加自選性實驗和自我設計實驗,以最大限度地培養(yǎng)學生的綜合實驗能力和創(chuàng)新能力。實驗室要面向學生開放,實現(xiàn)實驗教學的資源開放、時間開放、內容開放,增強實驗教學效果,提高資源利用率。
實驗考核由注重實驗結果轉變?yōu)樽⒅貙嶒炦^程。實驗指導教師不僅要客觀、公正地給出學生實驗成績,而且要指出其存在的問題及解決的辦法,注重學生動手能力的培養(yǎng),提高學生學習的積極性和主動性,提高其分析和解決問題的能力,增強實驗教學效果,增強學生的綜合素質。實驗考核包括平時考核和期末考核兩部分。平時考核的內容包括實驗預習、實驗操作、實驗態(tài)度及紀律、實驗報告等環(huán)節(jié),這部分成績占該實驗課總成績的60%;期末考試(包括實驗操作、技能、實驗理論等)占該實驗課總成績的40%。
【摘要】 【目的】 研究組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A(TSA)對人膀胱癌T24細胞的增殖抑制作用及對Apaf-1、APC基因表達的影響。 【方法】 采用3 × 10-4 mmol/L TSA作用T24細胞,MTT法檢測TSA對T24細胞生長的抑制作用;流式細胞術(FCM)檢測TSA作用前后T24細胞周期和凋亡的變化;逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測TSA作用前后膀胱癌細胞中Apaf-1、APC mRNA表達的變化?!窘Y果】 TSA對T24細胞的生長具有明顯的抑制作用;TSA作用后T24細胞的G0/G1期比例增加,S期比例減少,細胞凋亡率增加(P < 0.05);RT-PCR結果顯示TSA處理能明顯誘導Apaf-1、APC基因表達增加。【結論】 TSA能抑制T24細胞體外生長,誘導細胞周期阻滯和凋亡,其可能通過誘導Apaf-1、APC基因表達增加而發(fā)揮體外抗膀胱癌作用。
【關鍵詞】 膀胱癌; 曲古霉素抑菌素A; Apaf-1基因; APC基因
Abstract: 【Objective】 To investigate the effect of Trichostatin A (TSA), a histone deacetylase inhibitor (HDACi), on the growth of T24 human bladder cancer cells and the expression of Apaf-1 and APC in vitro, and to explore the possible mechanism. 【Methods】 T24 cells were treated with 3 × 10-4 mmol/L TSA; After treatment, cell growth was measured by MTT assay; Cell apoptosis changes and the cell cycle distribution were examined by flow cytometry (FCM). The expression of Apaf-1 and APC mRNA was detected by RT-PCR. 【Results】 TSA significantly inhibited the proliferation of T24 cells; Flow cytometry showed that the cells in G0/G1 phase and the apoptotic rates were significantly increased after treatment with TSA, while the cells in S phase were reduced.RT-PCR results showed that the Apaf-1 and APC mRNA level were promoted after TSA treatment. 【Conclusion】 TSA can inhibit T24 cells growth in vitro through inducing cell apoptosis and cell cycle arrest, which might be related to the expression of Apaf-1 and APC.
組蛋白乙?;揎検潜碛^遺傳調控最主要的研究內容之一,其通過改變染色質的構型調控基因轉錄,與惡性腫瘤具有密切的關系。抑制細胞內組蛋白去乙?;?histone deacetylase, HDAC)的活性,可增加組蛋白的乙?;潭?,具有抑制腫瘤細胞的生長,誘導分化和(或)凋亡的作用[1]。曲古抑菌素(trichostatin A,TSA)是一種氧肟酸類HDAC抑制劑,本研究應用TSA體外作用于人膀胱癌T24細胞株,觀察其細胞生物學行為改變和人凋亡蛋白酶活化因子-1基因(apoptosis protease activating factor-1,Apaf-1)、結腸腺瘤肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)表達的變化,探討TSA作用于膀胱癌的可能機制并為HDAC抑制劑應用于膀胱癌治療提供理論依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 細胞培養(yǎng)及主要試劑
人膀胱移行細胞癌細胞株T24購于中國科學院上海生物細胞研究所,培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素100 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基。在37 ℃、體積百分比為5%CO2飽和濕度條件下生長傳代,實驗時取對數(shù)生長期的細胞。TSA 為美國Sigma 公司產品,按說明配置成儲存液,用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成工作液。MTT、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)均購于廣州威佳生物公司,凋亡試劑盒(KGA108)購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,Trizol試劑,Tag酶,逆轉錄酶M-MLV,RT-PCR試劑盒均購于Takara公司,
1.2 細胞增殖抑制實驗(MTT)測定TSA對T24細胞系增殖活性的影響
取對數(shù)生長期,以臺盼藍檢測活力大于95%的T24細胞以104/孔密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板,每孔體積200 μL,細胞貼壁后以無血清培養(yǎng)基靜止24 h,實驗組加入終濃度為3 × 10-4 mmol/L TSA,對照組加入等量的培養(yǎng)液,各組均設3復孔。置于37 ℃,體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng),分別于24 h、48 h、72 h進行處理,每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL/孔,37 ℃,體積分數(shù)為5% CO2繼續(xù)孵育4 h,小心吸棄上清,加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μL/孔,充分混勻,于Bio-Tek酶標儀分析490 nm 處吸光度值。用下面的公式計算抑制率:抑制率(%) = (1 - 實驗組吸光度值/對照組吸光度值) × 100%。
1.3 流式細胞術(FCM)檢測T24細胞周期變化
取對數(shù)生長期的T24細胞按106/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后,給予3 × 10-4 mmol/L 的TSA分別處理24、48、72 h,對照組加入等量的培養(yǎng)液,各組每個時間點均設3個復孔。同期培養(yǎng)并同期用不含EDTA的胰蛋白酶收集處理后的細胞,800 r/min(r = 12 cm)離心10 min,沉淀采用300 μL PBS重懸,逐滴加入700 μL預冷的無水乙醇中,乙醇終濃度為70%,4 ℃避光固定過夜。800 × g離心10 min,去上清。PBS洗兩次。重懸細胞于500 μL含100 unit/mL的RNase A的PBS緩沖液中,避光,37 ℃孵育30 min。加2 mg/mL PI至終濃度50 μg/mL,避光孵育30 min。流式細胞儀檢測細胞周期。
1.4 流式細胞術(FCM)檢測T24細胞凋亡率變化
取對數(shù)生長期的T24細胞按106/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后,給予3 × 10-4 mmol/L 的TSA處理72 h,對照組加入等量的培養(yǎng)液,各組均設3個復孔。同期培養(yǎng)并同期分別以無EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶收集上清漂浮細胞和底壁細胞。加200 ?滋L binding buffer重懸,加入2 ?滋L AnnexinV-FITC,5 ?滋L PI,孵育后行流式細胞儀分析。
1.5 RT-PCR分析Apaf-1、APC基因的表達
用終濃度為3 × 10-4 mmol/L的TSA處理T24細胞,非藥物處理組作為對照,分別于24、48、72 h后收集細胞。Trizol法抽提總RNA。紫外分光光度儀檢測所抽提RNA的濃度和純度。用MMLV-RT逆轉錄酶按照說明合成cDNA,逆轉錄產物作為下步PCR模板。取逆轉錄cDNA 產物2 μL進行PCR擴增,PCR反應總體系為25 μL,反應條件為:95 ℃預變性5 min,循環(huán)內95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸25 s,擴增35個循環(huán)后72 ℃延伸5 min。Apaf-1上游引物為5′-TACAATCAGGCTCTGGGAGAC-3′,下游引物為5′-GTGAACTGGAT GTGCCATAC-3′,RT-PCR產物為323 bp。APC上游引物為5′-TCCTCCAGGTGAAA GGAAAG-3′,下游引物為5′-GGGTCACAGTGTTC ACATAC-3′,RT-PCR產物為297 bp。同時擴增β-actin作為內參照,上游引物為5′-TGGCACCCAGC ACAATGAA-3’,下游引物為5′-CTAAGTCATAGT CCGCCTAGAAGCA-3’,RT-PCR產物為186 bp,反應條件如上述。PCR產物經過2%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)進行半定量分析。
1.6 統(tǒng)計學處理
實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析,采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結 果
2.1 TSA對T24細胞增殖的影響
MTT實驗可見,TSA藥物對T24細胞生長增殖活性具有明顯抑制的抑制作用,3 × 10-4 mmol/L TSA作用24、48、72 h抑制率分別為(16.1 ± 1.2)%、(31.8 ± 2.5)%和(36.9 ± 1.3)%(圖1)。
2.2 TSA誘導T24細胞周期阻滯和細胞凋亡
與同時期對照組相比,流式細胞儀分析可見TSA作用24 h及48 h后,T24細胞G0/G1期細胞百分率升高,S期細胞百分率下降(P < 0.01);TSA作用72 h后S期細胞百分率下降,G2/M期細胞百分率較對照組升高(P < 0.01,表1)。Annexin V/PI雙染法檢測凋亡結果顯示TSA處理72 h后T24細胞凋亡率為(9.97 ± 1.83)%,同時期對照組細胞凋亡率為(5.60 ± 0.70)%,差異有統(tǒng)計學意義(P < 0.01),可見TSA能誘導T24細胞凋亡增加。
2.3 TSA對T24細胞中Apaf-1、APC基因mRNA表達的影響
半定量RT-PCR分析顯示3 × 10-4 mmol/L TSA處理T24細胞24 h后Apaf-1 mRNA表達較同時期對照組無明顯區(qū)別,但TSA處理48、72 h后,Apaf-1 mRNA表達水平較同時期對照組明顯升高(P < 0.05,圖2)。TSA處理T24細胞24、48、72 h,APC基因mRNA表達水平較同時期對照組均明顯升高(P < 0.05,圖3)。
3 討 論
組蛋白乙酰化修飾是表觀遺傳學的重要研究內容,是基因轉錄調控的重要機制之一,在腫瘤發(fā)生中具有重要作用。組蛋白乙?;D移酶(histone acetyltransferase, HAT)和去乙酰化酶的活性平衡是調控組蛋白乙?;乃降闹匾獧C制,其通過改變染色體構象而影響基因轉錄[1]。組蛋白的異常去乙?;瘜⑹够虮磉_失調,從而導致腫瘤發(fā)生,在白血病等腫瘤中已得到證實[2-3]。去乙?;敢种苿㏕SA能增加組蛋白乙?;?,影響基因轉錄,具有抗腫瘤作用[4];還有研究發(fā)現(xiàn)TSA在膀胱癌細胞系、乳腺癌細胞系中能誘導全基因組和特定基因啟動子的去甲基化[5],但其具體機制仍不清楚。
TSA體外作用于腫瘤細胞能抑制腫瘤細胞增殖、促進分化、誘導細胞凋亡,對小細胞肺癌等腫瘤具有明顯的抑制作用[6-7]。本研究中采用MTT法發(fā)現(xiàn)3 × 10-4 mmol/L TSA對膀胱癌T24細胞生長具有明顯的抑制作用,F(xiàn)CM檢測結果顯示TSA作用T24細胞72 h后T24細胞凋亡率為(9.97 ± 1.83)%,同時期對照組細胞凋亡率為(5.60 ± 0.70)%,凋亡率明顯升高(P < 0.01),并且 TSA作用24 h及48 h后,T24細胞G0/G1期細胞百分率升高,S期細胞百分率下降(P < 0.01),說明TSA可能通過誘導T24細胞凋亡和細胞周期阻滯而抑制T24細胞生長,與李功成、曲魏等的研究一致[8-9]。
已有研究發(fā)現(xiàn)TSA引起細胞周期阻滯可能與其上調腫瘤細胞中周期蛋白依賴性激酶抑制因子P21WAF1或抑制cyclin A的表達有關,而TSA誘導細胞凋亡的機制可能與其誘導腫瘤細胞中Bcl-2的下調和Bax的上調有關[8-9]。腫瘤細胞凋亡受眾多凋亡相關基因調控,具有兩條獨立的途徑:死亡受體途徑和線粒體介導的凋亡途徑。Apaf-1是線粒體凋亡途徑的關鍵調節(jié)因子,其結合自線粒體內釋放至胞漿的細胞色素 C,進一步激活Caspase-9,從而啟動 Caspase級聯(lián)反應,引起細胞凋亡[10]。細胞色素 C/Apaf-1/Caspase-9 途徑的激活依賴于 Apaf-1基因的正常表達。本研究中經RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)TSA作用72 h后T24細胞中Apaf-1 mRNA表達明顯上調(P < 0.01),同時伴隨有細胞凋亡的明顯增加,可見Apaf-1表達可能受組蛋白乙?;{節(jié),而TSA引起細胞凋亡的機制可能與其誘導Apaf-1的表達上調有關。
APC是Wnt信號的下游抑制因子,間接調節(jié)一系列參與調控細胞周期和凋亡的基因的表達,如cylinD1、c-myc、c-jun等。在Wnt信號通路中,Apc直接參與調節(jié)β-catenin在胞漿中的水平,當APC表達缺失可引起β-catenin在胞漿內聚集并轉運至核內,與轉錄因子TEF/LEF結合調節(jié)c-myc等癌基因的轉錄,引發(fā)腫瘤[11]。在膀胱癌中,APC表達異常常與其啟動子異常甲基化有關,且與腫瘤的復發(fā)和進展相關[12-13];而因突變或雜合性缺失(LOH)所導致的APC表達異常則較為少見[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)TSA處理T24細胞24、48、72 h,APC基因mRNA表達水平較同時期對照組均明顯升高(P < 0.05),說明APC的表達同時受組蛋白乙?;秸{節(jié),TSA導致的APC表達上調可能是TSA誘導膀胱癌周期阻滯和凋亡的重要機制之一。
本研究表明,組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA能顯著抑制膀胱癌T24細胞體外生長,誘導細胞凋亡及細胞周期阻滯,其機制可能與其誘導Apaf-1、APC mRNA的表達上調有關。
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