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關鍵詞 殼層隔絕納米粒子； 氰化物； 中毒血液樣品； 在線裂解吹掃捕集； 表面增強拉曼光譜
1 引 言
氰化物是一種廉價、速殺的血液性毒劑，中毒事件屢有發(fā)生[1～3]。氰化物吸收入體后，氰根可迅速與細胞線粒體內高鐵細胞色素氧化酶結合，生成氰化高鐵細胞色素氧化酶，使其失去傳遞氧的作用，造成組織缺氧，最終導致機體窒息，甚至死亡[4]。氰化物屬于劇毒物質，人體口服途徑的急性中毒致死劑量為0.48～3.37 mg/kg體重（氰根）[5]，在數(shù)分鐘內即出現(xiàn)急性中毒癥狀。因此，盡早發(fā)現(xiàn)、及時干預是有效救治的基本原則，而血液氰化物含量的現(xiàn)場快速檢測是指導中毒救治的首要前提。
目前，針對氰化物中毒生物樣本常用的檢測方法包括目視比色法[6，7]、分光光度法[8]、氣相色譜法[9]、離子色譜法[10]及色譜質譜法[11]等。其中，目視比色法和分光光度法等多利用氰化物和@色物質間的定量反應，靈敏度在0.01～ 1 mg/L水平，特異性較差； 而色譜（質譜）等方法中，氰化物（氰根或氧化物）自身屬于高極性小分子物質，除需衍生化或選擇特殊類型的色譜柱外，中毒生物樣品前處理過程復雜、耗時，使得上述方法僅適用于實驗室檢測。表面增強拉曼光譜（Surfaceenhanced Raman spectroscopy， SERS）技術具有靈敏度高、指紋譜準確識別、檢測速度快、適用于現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)點[12～16]，本課題組前期亦發(fā)展了芥子氣[17]、光氣[18]、百草枯[19]等化學毒劑毒物的SERS現(xiàn)場快速檢測方法。SERS技術在氰化物中毒現(xiàn)場檢測方面具有較大潛力。
本研究基于有孔殼層隔絕納米粒子（Pinhole shellisolated nanoparticles，pinSHINs），結合便攜式拉曼光譜，建立了一種血液氰化物快速SERS檢測新方法。PinSHINs極薄的有孔SiO2殼層能夠有效保護金核，極大地削弱了Au-CN配位形成可溶性復合物Au（CN）所導致的“溶金”效應，使其具有比普通金納米粒子（AuNPs）更優(yōu)越的穩(wěn)定性[20，21]。
但是考慮到與血細胞中細胞色素氧化酶結合的氰化物難以被直接檢測，常用強酸使結合態(tài)氰化物釋放產生HCN，再進行衍生化及分光光度法測定[8，22，23]，較為復雜、耗時。本研究構建了血液中氰化物的在線裂解吹掃捕集方法，以濃H2SO4酸化全血樣品，將結合態(tài)氰化物裂解，并轉化為揮發(fā)性的HCN氣體，經N2吹掃至堿液中形成NaCN，繼而直接對堿液進行SERS檢測，其靈敏度高、特異性強，操作方便快速，檢出限達10 μg/L。
2 實驗部分
2.1 儀器與試劑
所有SERS光譜于iRaman型便攜式拉曼光譜儀（美國 B&W TEK公司）上測定（激光波長785 nm，分辨率4.5 cm）。紫外可見吸收光譜（UVVis）于Cary 300型紫外可見分光光度計上（美國Varian公司）獲得。
NaCN（純度為99%，申領于軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所毒劑庫）； Na2SiO3（美國Sigma公司）； NaOH（國藥集團北京化學試劑公司）； 3氨丙基三乙氧基硅烷（ATPMS，美國Alfa Aesar公司）； 消泡劑為本課題組自制（主要成分為脂肪酸酯）； 真空封泥（酒泉祁天特種油品有限公司）； 15 mL離心管及96孔酶標板（美國Corning公司）； 肝素化采血管（江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司）。除特殊說明外，所有化學試劑均為分析純或以上。所有溶液均由超純水（MilliQ A10，美國Millipore公司）配制。雄性SD大鼠（SPF級180～200 g，北京維通利華動物實驗公司，許可證號：SCXK（京）20120001），飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心SPF級動物房。氰化物中毒患者全血樣品由軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院中毒救治科提供。
2.2 實驗方法
2.2.1 殼層隔絕金納米粒子的制備 首先用Frens檸檬酸鈉還原法[24]合成粒徑約為55 nm的金納米粒子（AuNPs），向制備好的55 nm AuNPs中加入1 mmol/L APTMS溶液，攪拌15 min，再加入Na2SiO3溶液 （0.54%， w/w） 并攪拌3 min，使AuNPs表面包覆生成SiO2殼層?？刂芅a2SiO3溶液的pH>11，即可生成1～2 nm厚的有孔SiO2殼層[25]。
2.2.2 NaCN標準溶液的配制 準確稱量NaCN 10.00 mg，用0.01 mol/L NaOH溶液溶解并定容至10 mL， 得1.00 g/L NaCN對照品溶液，于4℃保存。使用時，以0.01 mol/L NaOH溶液稀釋得到濃度為0.005、0.05、0.5、5和50 mg/L的工作溶液。
2.2.3 血液氰化物在線裂解吹掃捕集裝置的構建 血液氰化物在線裂解吹掃捕集裝置分為揮發(fā)裝置（A）、吸收裝置（B）和尾氣吸收裝置（C）三部分（圖1），3只15 mL離心管經相同孔徑導管相連，導管連接處均經真空泥密封，氣密性檢測表明裝置無漏氣。在裝置（A）中加入濃H2SO4，使結合態(tài)氰化物酸化裂解，生成HCN氣體，經氮氣吹掃至裝置（B），被其中的NaOH溶液充分吸收，形成NaCN，對吸收液進行SERS檢測； 裝置（C）連有一段活性炭管，以吸收多余的尾氣。在優(yōu)化條件下，裝置（A）中添加1 mL待測樣品、4 mL 12 mol/L H2SO4溶液和200 μL消泡劑（快速消除吹掃血樣時產生的大量泡沫，防止堵塞管路），裝置（B）和（C）中均加入1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液。
2.2.4 SERS檢測 取1 mL pinSHINs，5000 r/min離心5 min，去除上清液，與200 μL吸收液混合，移入96孔酶標板，進行SERS檢測。便攜式拉曼光譜儀參數(shù)為：激光功率90 mW，積分時間10 s。
2.2.5 NaCN染毒動物實驗 依據(jù)口服常用染毒劑量[26]及預實驗數(shù)據(jù)，按3 mg/kg（50%半數(shù)致死劑量LD50）的劑量向插管SD雄性大鼠灌胃染毒NaCN生理鹽水溶液，在注射之前抽取血液，設為“零”時間點。在注射后5 min，15 min， 30 min， 60 min， 2 h， 4 h和6 h各抽取血液500 μL于肝素化采血管中，按2.2.3和2.2.4進行檢測。
3 結果與討論
3.1 PinSHINs的表征
以 UVVis 吸收光譜、TEM及 HRTEM 對 pinSHINs 進行表征（圖2）。pinSHINs的最大紫外吸收峰位于536 nm處，半峰寬較窄，說明粒徑分布較均勻，計算得到的粒徑約為60 nm[27]； TEM表征下pinSHINs的粒徑約為55 nm； HRTEM表征下其Au核外包裹了約為1 nm的SiO2 殼層，在此厚度下，殼層中分布有大量孔隙[25]，氰根可通過孔隙與Au核表面直接接觸[21]，保持了對氰根響應信號的良好增強性能。
3.2 血液氰化物在線裂解吹掃捕集與SERS檢測
目前已報道的氰化物SERS檢測方法中，多存在“溶金”效應，檢測信號僅可穩(wěn)定存在5 min[28]； 且目前尚無血液中氰化物的SERS檢測報道。其難點在于，血液中的氰化物大部分與血細胞內細胞色素氧化酶生成結合態(tài)[29]，難以直接檢測。構建的在線裂解吹掃捕集裝置，以濃H2SO4酸化樣品，可將細胞中結合態(tài)氰化物裂解并轉化為揮發(fā)性的HCN氣體，經N2吹掃至堿液中，形成NaCN，無需任何復雜反應，后續(xù)采用pinSHINs為基底，可對堿性吸收液直接進行SERS檢測，即可得到靈敏且穩(wěn)定的氰根指紋譜信號（圖3A）。
經優(yōu)化后確定，濃H2SO4濃度12 mol/L、NaOH吸收液濃度0.1 mol/L、N2吹掃時間20 min為結合態(tài)氰化物裂解捕集最佳條件。將本方法與本課題組已報道的氰化物在線氫化產氣吹掃方法進行比較[19]，捕集效率提高了10倍（約為77%～81%）（圖3B）。
不同濃度NaCN（100～2000 μg/L）染毒全血實驗結果表明，2135 cm處SERS峰強度與NaCN濃度存在良好線性響應（y=17x+4393； R2=0.997）（圖4A），定量下限低于臨床上發(fā)生中毒反應時血液氰化物濃度（200 μg/L）[9]。低、中、高濃度（200、1000和1500 μg/L）下，本方法相對回收率為91%、106%和108%，RSD值為4.9%、7.6%和4.8%，表明方法可靠性和穩(wěn)定性較好。本方法的檢出限為10 μg/L，低于人血液氰化物致死濃度（LD100）1000 μg/L[27]兩個數(shù)量級，即可檢測到0.01 LD100，適合于檢測各種程度的氰化物中毒血液樣品。
常用的AuNPs易與氰化物發(fā)生“溶金”效應，且在強堿性條件下會過度團聚，導致檢測信號迅速衰減，而pinSHINs由于其外層包裹的SiO2殼層，有效削弱了“溶金”效應，且能耐受較寬的pH范圍，因此穩(wěn)定性得到了有效改善，SERS檢測信號1 h后依然可保持80%以上，如圖4B所示。5個批次pinSHINs的穩(wěn)定性采用低、中、高（200、1000和1500 μg/L）3個濃度NaCN加標全血樣品進行評估，氰根信號強度的相對標準偏差（RSD）分別為 6.2%、8.1%和7.7%，表明制備的pinSHINs具有良好的重復性。
3.3 染毒大鼠全血及臨床樣品氰化物濃度的檢測應用實例
利用本方法檢測了50% LD50的NaCN灌胃染毒大鼠不同時間點的全血樣品中氰化物濃度。如圖5A所示， NaCN灌胃10 min后，全血氰化物濃度迅速增加至最大值（2613 μg/L），血液中氰化物半衰期為56 min，與文獻＼[24＼]報道基本相符； 10～30 min氰化物在體內的代謝迅速下降； 30～100 min氰化物代謝緩慢降低； 6 h后，氰化物濃度趨于本底值。未染毒大鼠全血中檢測到少量內源性氰化物（經濃縮富集估算約30 μg/L），可通過隨行標準曲線排除其干擾。
將本方法用于臨床快速篩查氰化物中毒。分析了3份氰化物中毒患者全血樣品，一份為口服KAl（CN）4藥片39 h后的采集血樣（1#），另兩份為注射網(wǎng)購含氰化鉀或氯化琥珀膽堿的“捕狗藥”后的采集血樣（2#，3#），患者送醫(yī)時均深度昏迷，多臟器功能損傷，嚴重者呼吸心跳已經停止。按照本方法進行測定，1#和2#測得氰化物的濃度分別為910和530 μg/L，3#未檢出氰化物（考慮為氯化琥珀膽堿）（圖5B）。 為臨床及時救治提供了參考。
4 結 論
基于殼層隔絕納米粒子的強堿耐受性和能夠有效克服“溶金”效應的優(yōu)勢，以及所構建的在線裂解吹掃捕集裝置，建立了一種氰化物快速檢測SERS新方法，實現(xiàn)中毒全血結合態(tài)氰化物的有效解離、揮發(fā)及吸收，達到了快速、高靈敏定量檢測中毒血液中氰化物的目的。本方法已應用于氰化物灌胃染毒大鼠及臨床氰化物中毒血液樣本檢測，且所有SERS檢測均于便攜式拉曼光譜儀上完成，顯示出在氰化物中毒現(xiàn)場快速檢測良好的應用前景。預期除血液樣品外，本方法亦可適用于食品、環(huán)境復雜基質中的氰化物檢測。
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就電影市場而言，近段時間有部很紅的作品叫做《北京遇上西雅圖》。影片里的女主角文佳佳因為一部電影《西雅圖夜未眠》而來到自己向往的城市西雅圖待產，從而發(fā)生一系列的故事。都說故事源于生活，現(xiàn)實生活中，像文佳佳這樣因為一部電影就只身到異國他鄉(xiāng)的境遇也不在少數(shù)，且不只有小人物，國內很多已經成名的電影大腕，他們都愿意從代表著中國電影產業(yè)的橫店，飛往心目中向往的電影圣地好萊塢，哪怕只是演個小角色，哪怕露臉很短暫，哪怕播出時發(fā)現(xiàn)刪減版里沒有自己了――也同樣能告訴自己，沒關系，我最初的夢想只是想來打個醬油而已。
那些散落在外的“國產醬油瓶”
李冰冰 《生化危機5：懲罰》
角色：艾達?王
《生化危機》的角色分化很兩級，要么就是美女，要么就是喪尸。李冰冰這次出演了片中的旗袍女王艾達?王，無疑是個美女，跟游戲角色的還原度也很高，可是在一個早就被女主角米拉?喬沃維奇統(tǒng)治的系列中，李冰冰只在開頭打喪尸的部分秀了一下花拳繡腿，最終難免淪為跟班。不過李冰冰的團隊一直宣稱著自己的重要性，侃侃而談好萊塢的工作團隊如何為冰冰量身定做戲服、如何定制假發(fā)，簡言之就是好萊塢很重視她。
周迅 《云圖》
角色：酒店男經理、尤娜939、羅斯
前段時間有個很火的手機游戲叫“找你妹”，那么對于中國觀眾，《云圖》這部大牌云集的科幻大作在看不太懂之余，最能引發(fā)他們興趣的一個游戲就叫做“找周迅”。在影片中，周迅一人分飾三個不同時空不同類型的角色，飾演一個男人、一個女人、一個克隆人，盡管全部是顛覆性的造型，身邊站的也都是漢克斯這樣的大牌，但可惜的是每個角色都仍是標準龍?zhí)住?/p>
許晴 《環(huán)形使者》
角色：老布的女友
在《環(huán)形使者》里，許晴分到了不少動作戲――除了跟老布的感情戲，還大發(fā)脾氣摔東西……她在這部英語片的預告片中說了一句地道的中文普通話，只可惜從表情到念白到動作，就像在演《雷雨》之類的話劇，強烈的戲劇腔與老外的自然風反差明顯。到在內地上映的時候，我們還可以看到她5分鐘的戲份，還有臺詞；而在北美版，許晴的臺詞干脆全部被刪掉。
李小璐 《異能》
角色：有預見未來能力的女孩
就國內觀眾而言，李小璐的形象是個清純、任性、受氣包的小媳婦形象。但是到了好萊塢，她成了一個走陰險路線的大反派，以往甜美的笑容換成了努力地扭曲面部肌肉，未免顯得過于猙獰。在《異能》里，李小璐說了兩種語言――英語和粵語，就是沒有普通話，看得人憋屈死了。不過在與達寇塔?范寧的對戲中我們終于可以確定一件事，就是李小璐的眼睛更大。
黃圣依 《巫山歷險記》
角色：COSPLAY女孩
出現(xiàn)在一部智商6歲的兒童片里不算什么，只是來打個醬油也不算什么，但是在《巫山歷險記》里露了一下臉的黃圣依，短短5秒的出場時間恐怕還不夠化妝費得勁多：白色假發(fā)、銀色胸罩、別著一把寶劍……十足的非主流扮相，目送女主角出電梯，嘴巴微張，好像要說點什么，但最終什么也沒說，于是，這個醬油瓶真的就華麗麗地被觀眾無視了。
李連杰 《敢死隊2》
角色：陰陽
在《敢死隊》第一集就一直叨叨著想要退休的“陰陽”李，終于在《敢死隊2》里達成心愿，被編劇在10分鐘內寫出局，成功辦了“內退”。不過看得出來，史泰龍對咱們這位動作明星很是厚道，在他瀟灑展示完招牌的中國功夫后，安排他跳傘回到了祖國的懷抱――這無論是比坐飛機還是坐高鐵，都要快得多啊。
陳冠希 《蝙蝠俠：黑暗騎士》
角色：接機男
傳說冠希哥是因為英文極佳才可以出演《黑暗騎士》，可惜導演分給他的臺詞簡單得就像初一英語課本里李雷問候韓梅梅“How are you？”“Fine，Thank You，And you？”一樣簡單，讓人大跌眼鏡，淪為“男花瓶”。
周潤發(fā) 《加勒比海盜3》
角色：海盜邵峰
這個系列一直有糟蹋演員的臭名聲，發(fā)哥也不幸中槍，化了個好像被燙傷的臉妝，留著八字胡，慈禧老佛爺?shù)拈L指甲，除了一拳打斷萬人迷德普的鼻子，其余時間都在凹造型。而且，影片中的發(fā)哥好像嫌自己還不夠高大，一定要仰著頭說臺詞，以表現(xiàn)角色的趾高氣揚，就像費玉清在唱歌。可惜遇上不解風情的廣電總局，把發(fā)哥在開場的表演給刪光了。
大明星為何熱衷西游“打醬油”
也許是因為語言畢竟不同，也許是因為好萊塢對中國影星的印象還僅僅停留在“中國功夫”，即使在國內再大牌的“腕兒”，到了好萊塢都難免淪為龍?zhí)?、跟班、醬油瓶?？蔀槭裁醇幢闳绱耍€是有一眾明星擠破了頭也想去好萊塢“西游”一圈呢？
首先，作為一個龐大的電影城，好萊塢早就無形中成為美國電影，甚至是全球音樂電影產業(yè)中心地帶的代名詞，這里的時尚與科技互相牽制發(fā)展，是不造作的，擁有著深厚的時尚底蘊和雄壯的科技做支持，一直被全球各地爭相模仿，自然也是眾家明星向往之地。
其次，好萊塢影片的劇本和當中精彩的元素都吸引著演員去挑戰(zhàn)。就像周迅解讀自己參演《云圖》的意圖時曾說：“參演這個電影是因為我對角色和故事很感興趣，我也喜歡做一些有挑戰(zhàn)性的工作?！?/p>
除了榮耀之外，對于明星們而言，能在一部全球放映的好萊塢電影中有良好的表現(xiàn)，就意味著有更多宣傳自己的機會，名氣擴大，甚至會因此接到更多的代言。一般女星的經紀方都會跟好萊塢片方商量，是否能讓這個女星領銜該片在亞洲地區(qū)的宣傳。這種事既賺面子又賺錢，當然要盡力爭取。
好萊塢為何需要中國“醬油瓶”
而作為好萊塢方面，為什么也樂意敞開胸懷，頻頻接受大批中國明星前來“打醬油”呢？在《生化危機5》宣傳時，作為走進好萊塢的中國女星之一，李冰冰方面也表示，“中國火熱的電影市場確實吸引了很多制片商，中國元素也成為他們選擇的一個因素?！碑斣絹碓蕉嗟闹袊餍橇料嗪萌R塢電影，就意味著好萊塢影片更容易進入中國市場。而中國票房不斷走高，市場看好，好萊塢自然不會漠視。
還有一種觀點，就是認為好萊塢影片加入大量的中國元素，實際上是在鉆“合拍片”的空子。國家廣電總局副局長張丕民就在央視電影頻道舉辦的研討會上，提出今后要嚴格審查中美合拍片。原來，繼去年廣電總局出臺了限制“美國大片”播出時間和分成的一系列政策后，一些進口大片因為加入了中國元素，便借此以“合拍”標簽躲過政策。張丕民說，“投點小錢，甚至有的連錢都不投，一個美國故事加上點中國元素，帶上一個中國演員，這就叫合拍片了，這是非?？膳碌?。還理所當然以中國影片的身份在最好的檔期占了最長的時間?！辈贿^，這種觀點未免有些小人之心度君子之腹，畢竟，能看到國內的明星大腕兒們走進好萊塢，也是一種中國式驕傲。
橫店遇上好萊塢