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有一次，我往籠子里放進(jìn)去兩片胡蘿卜，剩下的幾片我放在籠子上面。過了一會(huì)兒，我再來一看，嘿，這兩個(gè)小東西已經(jīng)把籠子里的那兩片胡蘿卜吃完了，正并排蹲在那兒抬著頭，眼巴巴地望著籠子頂上的幾片胡蘿卜，小嘴不停地動(dòng)著，饞得口水都快流出來了。一看那樣子我就笑了，趕忙拿了那幾片胡蘿卜送給它們吃。還有一次，我拿了幾片白菜葉從籠邊走過。
只見它們的四只小眼睛一直盯著這兩片白菜葉，還不停地叫著，好像在說：“我要吃白菜！我要吃白菜！你為什么不給我們呀？”我沖它們笑了笑說：“小傻瓜，這些白菜太臟了，吃了會(huì)生病的，我馬上給你們換些干凈的來，好好等著，誰(shuí)再叫就不給誰(shuí)吃。”它們好似聽懂了我的話，不再叫喚了?？裳劬€是盯著我手里的菜葉，我趕快拿來一些干凈的白菜葉喂它們。剛一扔進(jìn)籠子里，它們就趕快用兩只小爪子按住了菜葉，兩雙圓眼睛開始盯著我，可能是怕我反悔了再把白菜搶走。見這情景，我趕忙躲到一旁，不再去驚動(dòng)它們，好讓這兩個(gè)精靈的小家伙安心地吃。
小豚鼠不光吃東西有意思，睡覺也挺有趣。它們睡覺的時(shí)候肚皮總是緊緊地貼在地上，好像大地是暖和的床。它們的前腿往前伸，后腿往后伸，小眼睛閉得緊緊的，那樣子真逗人笑。
小豚鼠雖然大小便不太講衛(wèi)生，但是吃東西挺講究衛(wèi)生的，每次吃完了飯，它總要用小舌頭舔舔自己的小手，然后再洗一洗臉?？杀饶切┎恢v衛(wèi)生的小朋友乖多了。你別看這兩只小豚鼠性情那么溫柔，就猜想它們一定是慢條斯理的。其實(shí)呀，它們的動(dòng)作可快了！有一次，我剛打開籠門想給它們喂點(diǎn)東西吃，可是，它倆一下跑了出來。當(dāng)時(shí)我想：這可糟了！可還沒等我抓住它們，它倆已經(jīng)扭頭又跑回了籠子，多調(diào)皮！當(dāng)時(shí)我覺得又可氣又可笑，就對(duì)它們慎怪地說：“狡猾的小東西，想跟我開玩笑，是吧？”
小豚鼠還有一個(gè)最可愛之處，那就是伙伴之間重視友情。原來的兩只小豚鼠，在一起生活了很長(zhǎng)時(shí)間，它們之間親親熱熱，玩玩鬧鬧，非常友好，誰(shuí)也不欺負(fù)誰(shuí)，還經(jīng)常在一起說悄悄話。后來，其中的一只不幸被別人弄死了，留下的這只小豚鼠天天望著它失去伙伴的地方，十分傷心，它的眼角常常是濕潤(rùn)的，像是在流淚，還不停地發(fā)出難過的叫聲，像是在呼喚它失去的朋友。為了不讓它感到寂寞，我們就又給它找來一個(gè)新伙伴。因?yàn)閼涯罾吓笥?，它開始好像不愿意跟新伙伴在一起，常常想把它拱出去。后來我們告訴它：“老朋友既然已經(jīng)死了，來了新伙伴，就應(yīng)該對(duì)它熱情友好，不能欺負(fù)它！”它像是聽懂了，不再往外擠它，還主動(dòng)和它接近。它們漸漸地熟悉了，不再打架，也不再搶食，常親親熱熱地貼在一起我看見了心里很感動(dòng)：小豚鼠這種小動(dòng)物是多么可愛呀！它們那么懂得珍視友情，這種品格是可貴的！我們小朋友之間呢？也應(yīng)該像它們那樣互相友愛，誰(shuí)也不欺負(fù)誰(shuí)；應(yīng)該比它們更珍惜感情，更珍惜友誼。
【摘要】 目的：觀察健兒強(qiáng)身膏對(duì)支氣管哮喘豚鼠模型肺組織病理的影響。方法：采用卵蛋白（OVA）致敏法制備豚鼠哮喘模型，將豚鼠隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、中藥（高、中、低）3個(gè)劑量組，分別觀察各組引喘潛伏期（T）、支氣管和肺組織的病理及超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：健兒強(qiáng)身膏3個(gè)劑量組均能延長(zhǎng)豚鼠哮喘誘發(fā)潛伏期，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
【關(guān)鍵詞】 哮喘；健兒強(qiáng)身膏；豚鼠；肺組織病理
[Abstract] Objective: To observe the effect of Jianerqiangshen electuary on bronchial tube and pulmonary morphology of asthmatic guinea pigs. Methods: The asthmatic guinea pig model was established with the ovalbumin（OVA） challenge methods. Forty-eight guinea pigs were randomly pided into six groups: normal control group，asthma model group，DXM –treated group，three dose groups of Jianerqiangshen electuary. The effects of relieving asthmatic attacks were observed，and pulmonary morphology and ultramicrostructures were observed too. Results: Compared with the model group，Jianerqiangshen electuary groups could prolong the latent period of asthmatic attack significantly（P
[Key words] Asthma；Jianerqiangshen electuary；Guinea pig；Pulmonary pathology
哮喘是由多種細(xì)胞，如嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞等和細(xì)胞組分共同參與的氣道慢性炎癥疾病，也是兒童期最常見的慢性疾病。目前，主要應(yīng)用于臨床的治療藥物是緩解癥狀和控制發(fā)作的藥物。長(zhǎng)時(shí)間使用具有一定的副作用。而中醫(yī)藥在治療哮喘方面具有效果顯著穩(wěn)定、藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、副作用小、善于預(yù)防和治本的優(yōu)點(diǎn)[1]。健兒強(qiáng)身膏是南通市中醫(yī)院江蘇省名中醫(yī)鄂惠的效應(yīng)方，在臨床中能有效控制哮喘發(fā)作期癥狀，可使易感兒童呼吸道感染次數(shù)減少，哮喘的發(fā)病率下降。本實(shí)驗(yàn)旨在基于顯著臨床療效的基礎(chǔ)上，進(jìn)行其藥效學(xué)及作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究，觀察其對(duì)哮喘豚鼠肺組織的病理變化，為中藥防治哮喘提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康2月齡普通級(jí)豚鼠，體重240～320 g，雌雄不拘，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2001-0011。實(shí)驗(yàn)期間分籠飼養(yǎng)于安靜室內(nèi)，自然光照，室溫20～26 ℃，濕度40%～70%，飼喂全價(jià)顆粒料和新鮮蔬菜，每周換墊料1次。
1.1.2 藥品及試劑 健兒強(qiáng)身膏口服液：由南通市中醫(yī)院制劑室按制備工藝生產(chǎn)提供，每毫升相當(dāng)于生藥1 g[生產(chǎn)批文號(hào)：通制劑（2001）04—125]。藥物主要組成成分：黨參、炒白術(shù)、茯苓、炒白芍、山藥、炒谷麥芽、焦楂曲、黃芪、黃精、南北沙參、菟絲子、山芋肉、桑葚子、女貞、生熟地、川斷、陳皮、甘草、仙靈脾、天麥冬、蒸百部、紅棗、浮小麥、法半夏、黃芩、補(bǔ)骨脂。陽(yáng)性對(duì)照藥：地塞米松磷酸鈉注射液（江蘇漣水制藥有限公司，批號(hào)：0411171）。致敏劑：卵蛋白（OVA），上海伯奧生物科技有限公司，批號(hào)0050114。
1.1.3 主要儀器 PARIBOY超聲霧化機(jī)，德國(guó)百瑞；密閉透明容器（320 mm×260 mm×200 mm），自制；奧林巴斯CX41顯微鏡，日本；形態(tài)圖像分析系統(tǒng)，南京捷達(dá)公司；外科手術(shù)器械1套。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 動(dòng)物分組及劑量 取符合實(shí)驗(yàn)要求的豚鼠48只，隨機(jī)分成6組：空白對(duì)照組（正常組）、哮喘模型組、地塞米松治療組：地塞米松1 mg/kg體重、健兒強(qiáng)身膏低劑量組：生藥4 g/kg體重、健兒強(qiáng)身膏中劑量組：生藥8 g/kg體重、健兒強(qiáng)身膏高劑量組：生藥16 g/kg體重，每組8只。
1.2.2 造模及給藥方法 按照國(guó)際上通用的方法，以經(jīng)典的卵蛋白致敏和攻擊復(fù)制動(dòng)物模型[4]。除空白對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物每只分別腹腔注射10%卵蛋白生理鹽水溶液1 ml致敏，于第15、16、17天，將豚鼠逐個(gè)放入自制密閉容器中，超聲霧化機(jī)衡壓噴入1%卵蛋白生理鹽水溶液30 S任其自由吸入，觀察豚鼠呼吸節(jié)律、深度、膈肌收縮及有無抽搐跌倒等呼吸道痙攣梗阻等癥狀。其強(qiáng)度可分為四級(jí)：Ⅰ：呼吸加??；Ⅱ：呼吸困難，點(diǎn)頭呼吸；Ⅲ：腹肌痙攣，抽搐；Ⅳ：翻滾跌倒甚至死亡。出現(xiàn)上述癥狀即為造模成功。此時(shí)立即取出動(dòng)物，置通風(fēng)處，換氣。同時(shí)記錄引喘潛伏期（T），并進(jìn)行比較。潛伏期：從吸入1%卵蛋白生理鹽水溶液到腹肌痙攣、抽搐的時(shí)間。從第18天開始給藥。模型組每天給予生理鹽水10 ml/kg灌胃，中藥低、中、高各組按規(guī)定劑量灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組按1 mg/kg體重腹腔注射給藥，連續(xù)給藥18天。并與給藥后第6、12、18天分別誘喘1次，同時(shí)記錄哮喘發(fā)作潛伏期。空白組以生理鹽水替代卵蛋白同步實(shí)驗(yàn)。
1.2.3 標(biāo)本采集 最后1次給藥后24 h內(nèi)，每只豚鼠稱重后用3%戊巴比妥鈉1 ml/kg注射，麻醉后腹主動(dòng)脈放血處死。迅速選取右肺中葉于4%多聚甲醛（含1‰DEPC）中固定48 h后，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡觀察。
迅速取火柴頭大小的右下肺組織標(biāo)本，用3%戊二醛固定，1%四氯化鋨后固定，Epon-812樹脂包埋，做超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察并照相。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析， P
2 結(jié)
果
2.1 健兒強(qiáng)身膏對(duì)哮喘豚鼠引喘潛伏期的影響 見表1。治療后，哮喘模型組引喘潛伏期與治療前比較未見明顯差異。
2.2 肺組織病理變化觀察 正常組：細(xì)支氣管黏膜上皮排列整齊，細(xì)支氣管壁內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌周圍偶見Eos（圖1A1-2）；哮喘組：細(xì)支氣管黏膜上皮排列紊亂、增生明顯，支氣管黏膜及黏膜下層組織有大量的Eos、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管壁增厚，管腔狹窄，腔內(nèi)有大量的上皮細(xì)胞脫落，組織黏膜充血水腫明顯等典型的氣道炎癥表現(xiàn)（圖1B1-2）；地塞米松治療組：組織黏膜仍有比較明顯的充血水腫等，但Eos浸潤(rùn)較哮喘組豚鼠明顯減輕，可見到淋巴細(xì)胞等，腔內(nèi)有少量的上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞。（圖1C1-2）；健兒強(qiáng)身膏治療組：與地塞米松治療組相似，Eos浸潤(rùn)較哮喘組豚鼠明顯減輕，可見淋巴細(xì)胞等，組織仍有充血水腫，腔內(nèi)有少量的上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞。其中高、中劑量組支氣管管腔擴(kuò)大，肺泡間隔明顯變薄，肺泡腔變大，肺泡區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少（圖1E1-2，1F1-2），中藥低劑量組（圖1D1-2）有所減輕。
2.3 肺組織電鏡觀察結(jié)果 正常組細(xì)支氣管、肺泡壁及肺泡細(xì)胞等均正常。哮喘模型組可見嗜酸性粒細(xì)胞，可見EOS脫顆粒，顆粒中有特異性結(jié)晶核。肺泡壁擴(kuò)張，毛細(xì)血管充血。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞腫脹，部分空泡化，板層小體排空。健兒強(qiáng)身膏各治療組病變較模型組均有不同程度的減輕（圖2）。
3 討
論
哮喘，中醫(yī)認(rèn)為素體肺、脾、腎三臟不足，痰飲留伏，是發(fā)病的主要內(nèi)在因素，氣候轉(zhuǎn)變，寒溫失調(diào)，接觸異物，過食生冷咸酸，是發(fā)病的重要條件。中醫(yī)在哮喘防治方案中，根據(jù)正虛痰伏辨證要點(diǎn)，“未發(fā)以扶正氣為主，既發(fā)以攻邪為急”（《丹溪心法》），在緩解期扶脾益腎，補(bǔ)土生金，調(diào)其臟腑功能，去其生痰之因，以冀減輕和制止發(fā)作，臨床上常用單味黃芪、玉屏風(fēng)、六味地黃丸等作為免疫增強(qiáng)劑[2]，以期通過提高小兒的免疫能力，來減少小兒哮喘的發(fā)作。健兒強(qiáng)身膏，方源取之《太平惠民和劑局方》中的四君子湯，以四君子為主方，固本以益養(yǎng)脾肺，又適當(dāng)加用了補(bǔ)肺補(bǔ)腎之品，起到調(diào)理臟腑、強(qiáng)筋健骨之效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，四君子湯可促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生IL-1、IL-2及干擾素[3]，具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能[4]。通過實(shí)驗(yàn)可以觀察到健兒強(qiáng)身膏的3個(gè)劑量組均能延長(zhǎng)致敏豚鼠的引喘潛伏期，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
目前病理學(xué)研究表明，支氣管哮喘氣道炎癥的病理學(xué)改變主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）氣道黏膜組織中可見大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以嗜酸細(xì)胞(Eos)為主，其次是肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等；（2）氣道上皮損傷與脫落，纖毛細(xì)胞有不同程度的損傷脫落；（3）氣道壁增厚，黏膜水腫，膠原蛋白沉著；（4）支氣管黏膜下黏液腺增生，杯狀細(xì)胞肥大、增生，氣道內(nèi)黏液分泌增加并儲(chǔ)留在支氣管內(nèi)形成黏液栓；（5）氣道平滑肌的肌層增生，基底膜變性增厚等[5-6]。其中嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞之一，且嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度與哮喘病情的嚴(yán)重性相關(guān)[7-9]。其通過釋放已經(jīng)生成并儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)的炎癥介質(zhì)和新生炎癥介質(zhì)起作用，損傷氣道上皮。上皮細(xì)胞壞死、脫落，暴露氣道上皮神經(jīng)末梢使之受損、引起膽堿能神經(jīng)處于超敏狀態(tài)；氣道上皮損傷又使吸入的各種刺激物不能被及時(shí)排出并沉積在氣道黏膜表面，使氣道處于超敏狀態(tài)[10]。
本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：空白組的支氣管和肺組織結(jié)構(gòu)正常，管腔內(nèi)無明顯滲出物，支氣管黏膜上皮完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少見。而哮喘模型組肺泡內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜水腫擴(kuò)張，管腔變窄；腔內(nèi)可見有炎性滲出、脫落的上皮等，支氣管壁及管周大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)呈袖套狀。電鏡觀察顯示模型組肺泡間隔明顯增厚，細(xì)胞成份增多，基底膜增厚；肺泡Ⅱ型上皮腫脹，板層體排空，可見嗜酸性細(xì)胞脫顆粒，顆粒中有特異性結(jié)晶核，支氣管平滑肌增生、肥大，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、管壁增厚，內(nèi)充滿大量紅細(xì)胞。其病理改變符合上述情況，證實(shí)模型的復(fù)制是成功的。
通過實(shí)驗(yàn)我們觀察到地塞米松干預(yù)后Eos浸潤(rùn)明顯減輕，病理改變明顯。目前認(rèn)為地塞米松影響Eos浸潤(rùn)的主要機(jī)制為抑制Eos的趨化和誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡。地塞米松可作為多種炎癥介質(zhì)釋放的抑制劑，而其中許多介質(zhì)可誘導(dǎo)Eos的趨化，如PAF(血小板活化因子)、IL-5等。上皮細(xì)胞是Eos趨化因子的主要來源，亦是激素的主要靶細(xì)胞，其可使上皮細(xì)胞因子的表達(dá)顯著下調(diào)[11]。Wallen等[12]體外實(shí)驗(yàn)表明地塞米松可顯著阻止IL-5、IL-3等對(duì)Eos凋亡的抑制作用，加速Eos的凋亡。國(guó)內(nèi)鄧立力等[13]研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松可以通過下調(diào)哮喘大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)，糾正MMP-9/TIMP-1的平衡，抑制哮喘模型氣道平滑肌增生和氣道壁增厚。
通過對(duì)病理切片的觀察，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)中藥治療后各劑量組上氣道炎癥及肺組織病理癥狀與模型組相比均有改善，其作用與劑量成正相關(guān)性。特別是大劑量組病理改變明顯減輕，支氣管周圍和黏膜層及肺泡區(qū)結(jié)構(gòu)基本正常，無明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道、血管平滑肌及肺泡壁無明顯增厚，肺泡腔無明顯改變。證實(shí)健兒強(qiáng)身膏具有抑制氣道、肺組織炎癥作用，其作用效果類似地塞米松。
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【關(guān)鍵詞】 哮喘；氣道重構(gòu)；明膠酶B；金屬蛋白酶1組織抑制劑
【Abstract】 AIM: To investigate the roles of matrix metalloproteinase9 (MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1) in airway remodeling of asthmaric guinea pigs. METHODS: Guinea pigs were sensitized with ovalbumin conjuncted with Al(OH)3， and subsequently challenged repeatedly with ovalbumin aerosol. The guinea pigs were randomly pided into the control group，asthmatic 4， 6， 8week groups. The expressions of MMP9 and TIMP1 in bronchi and lung tissues were observed by immunohistochemistry combined with the microimage analysis．The levels of MMP9 mRNA and TIMP1 mRNA were determined by semiquantitative PCR. RESULTS: ① After repeated allergen challenge， smooth muscle hyperplasia was obvious in guinea pig bronchi．Expression levels of MMP9 and TIMP1 in the epithelial cells of bronchi were significantly higher in asthmatic animals than those of control group． ② The expression of MMP9 in asthmatic guinea pigs lung tissues was 0.52±0.05 in 4week group， 0.74±0.05 in 6week group， 0.48±0.04 in 8week group ， 0.21±0.04 in control group （P
【Keywords】 asthma; airway remodeling; gelatinase B; tissue inhibitor of metalloproteinase1
【摘要】 目的： 探討哮喘豚鼠模型中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制因子(TIMP)在哮喘氣道重構(gòu)發(fā)病中的作用. 方法： 重復(fù)霧化吸人卵蛋白建立豚鼠哮喘氣道重構(gòu)模型. 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、哮喘激發(fā)4， 6 和8 wk組. 免疫組化方法結(jié)合顯微圖像分析檢測(cè)MMP9， TIMP1的表達(dá). 半定量PCR檢測(cè)MMP9及TIMP1mRNA水平. 結(jié)果： ① 哮喘各組動(dòng)物均出現(xiàn)管壁增厚、平滑肌增生等氣道重構(gòu)的特征性改變. ② 哮喘豚鼠MMP9的mRNA表達(dá)：哮喘4 wk組為（0.52±0.05），哮喘6 wk組為（0.74±0.05）；哮喘8 wk組為（0.48±0.04）；對(duì)照組為（0.21±0.04）；哮喘各組與對(duì)照組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
【關(guān)鍵詞】 哮喘；氣道重構(gòu)；明膠酶B；金屬蛋白酶1組織抑制劑
氣道重構(gòu)是氣道反復(fù)炎癥損傷與修復(fù)的結(jié)果，是造成哮喘患者不可逆氣道阻塞的病理生理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）的沉積、基底膜增厚、氣道平滑肌增生和肥厚等改變. 其中ECM在氣道壁沉積過多是引起氣道壁纖維化和氣流阻塞的主要原因之一［1］. 正常ECM的合成與降解處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡之中，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases， MMP9)與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase， TIMP1）平衡是維持ECM內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的決定因素［2］. 本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制豚鼠哮喘模型，利用免疫組化和RTPCR方法測(cè)量不同階段哮喘豚鼠模型肺中MMP9及TIMP1含量變化，并了解MMPs/TIMP在哮喘發(fā)病中的作用.
1材料和方法
1.1材料卵蛋白、結(jié)合生物素的羊抗兔IgG血清、ABC復(fù)合物均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗TIMP1抗體、兔抗MMP9抗體購(gòu)自武漢博士德公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Taq酶購(gòu)自日本Promega公司；MMP9和TIMP1上下游引物由北京奧科公司合成；402型超聲霧化吸入器購(gòu)自上海合力醫(yī)療器械廠；PTC100型PCR儀為美國(guó)BioRab公司產(chǎn)品；雄性豚鼠32只，體質(zhì)量200～250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供.
1.2方法
1.2.1動(dòng)物分組及模型制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和哮喘4， 6和8 wk組，每組8只. 各哮喘組于第1日腹腔注射卵蛋白(含等量氫氧化鋁凝膠)0.1 mg，1 wk后霧化吸人10 g/L濃度的卵蛋白溶液激發(fā)哮喘，隔日1次，每次20 min，根據(jù)分組分別激發(fā)4，6和8 wk. 第1次激發(fā)后豚鼠即開始喘息，表現(xiàn)為呼吸加深加快，肋間隙凹陷，哮喘發(fā)作嚴(yán)重者可出現(xiàn)窒息；喘息后即將動(dòng)物移出瓶外，喘息可持續(xù)30 min，甚至更長(zhǎng)；對(duì)照組同樣于第1日腹腔注射生理鹽水0.9 mg，1 wk后將動(dòng)物置于半封閉玻璃罩內(nèi)霧化吸人生理鹽水約20 min，隔日1次，霧化吸入生理鹽水8 wk.
1．2．2動(dòng)物模型肺組織取材、固定、切片各組模型于末次激發(fā)48 h后以戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉豚鼠，開胸留取豚鼠左肺置于液氮中速凍，-70℃保存?zhèn)溆茫?jīng)肺動(dòng)脈灌注100 mL生理鹽水，繼以新配制的40 g/L多聚甲醛PBs（0.1 mol/L，pH 7.4）600 mL持續(xù)灌注90 min，并將右肺取下后固定24 h，入200 g/L蔗糖+含氟PB溶液中，4℃過夜至標(biāo)本下沉，OCT包埋，恒冷箱切片機(jī)連續(xù)切片（厚15 μm），-20℃保存?zhèn)溆?
1．2．3免疫組化染色肺組織切片貼于載玻片上，室溫干燥30 min后，以0.01 mol/L KPBS(pH 7.4)浸洗，經(jīng)800 mL/L甲醇+30 mL/L H2O2封閉15 min，KPBS浸洗3次×10 min，切片入兔抗MMP9血清(1∶100)室溫孵育24 h. KPBS浸洗3次×10 min，入結(jié)合生物素的羊抗兔IgG血清(1∶500)，室溫孵育2 h，KPBS浸洗3次×10 min，入ABC復(fù)合物(1∶500)室溫孵育2 h，葡萄糖氧化酶DAB硫酸鎳胺法顯色. 顯色反應(yīng)終止后，常規(guī)脫水，中性樹膠封片. 同樣方法利用兔抗TIMP1染色切片. 每張切片在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)支氣管，以棕黃色顆粒在胞質(zhì)的沉積為陽(yáng)性. 圖像分析各支氣管細(xì)胞染色的平均密度以代表MMP9， TIMP1的表達(dá)強(qiáng)度.
轉(zhuǎn)貼于
1．2．4MP9及TIMP1半定量PCR用Trizol試劑提取備用肺組織總RNA；合成cDNA；半定量PCR反應(yīng)體系：Taq酶33.34 nkat， Buffer 2 μL，dNTP (10 μmol/L)1 μL，MMP9上游引物(5′AAGGATGGTCTACTGGCACA3′)10 μmol/L， 0．5 μL，MMP9下游引物(5′GAAGATGAATGGAAATACGC3′， 10 μmol/L，）0.5 μL，模板1 μL，總反應(yīng)體積20 μL. 反應(yīng)條件：94℃ 1 min；56℃ 45 s；72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán). TIMP1引物：上游5′ACAGCTTTCTGCAACTCG3′，下游5′CTATAGGTCTTTACGAAGGCC3′，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為364 bp；條件：98℃，變性10 min，然后再94℃變性1 min，61 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后，72℃延伸10 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后采用凝膠成像分析系統(tǒng)讀取其灰度值.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 各組間數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用ONEWAY ANOVA分析，組間兩兩比較采用SNKq檢驗(yàn)，P
2結(jié)果
2.1哮喘動(dòng)物模型的制作本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組豚鼠每次霧化吸人生理鹽水均未見動(dòng)物發(fā)生哮喘；各哮喘組第1次霧化吸人卵蛋白溶液可見哮喘發(fā)作，約激發(fā)3次可見明顯哮喘發(fā)作，哮喘發(fā)作重者甚至可窒息致死.
2.2組織病理學(xué)改變各組豚鼠肺組織冰凍切片光鏡下見：哮喘各組細(xì)支氣管上皮變性，細(xì)胞脫落，支氣管黏膜皺襞增多，肺泡隔增厚明顯，并隨著激發(fā)時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸增厚，在哮喘8 wk組表現(xiàn)最為明顯. 對(duì)照組豚鼠肺組織支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)正常(圖1).
2.3MMP9及TIMP1在豚鼠模型肺組織的表達(dá)結(jié)果顯示，哮喘各組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P
2.4豚鼠模型肺組織中MMP9和TIMP1 mRNA的表達(dá)水平由表2可見，MMP9的表達(dá)哮喘各組均高于正常對(duì)照組(P
A：對(duì)照組；B：激發(fā)4 wk組；C：激發(fā)6 wk組； D：激發(fā)8 wk組. 圖1各組豚鼠氣道的HE染色結(jié)果×200表1各組豚鼠支氣管MMP9， TIMP1免疫組化結(jié)果及MMP9/TIMP1比值變化(n=8， x±s)表2各組豚鼠支氣管MMP9， TIMP1 mRNA表達(dá)及MMP9/TIMP1比值變化(n=8， x±s)
3討論
長(zhǎng)期以來，人們認(rèn)為氣道重建的發(fā)生是在慢性炎癥基礎(chǔ)上逐漸進(jìn)展的［3］. MMPs是調(diào)節(jié)ECM 代謝的主要限速酶，并在組織細(xì)胞的分化、維持正常組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管形成、創(chuàng)傷的愈合、炎癥反應(yīng)等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用. 所有的MMPs中，MMP9和哮喘關(guān)系最密切［4］. MMP9能降解多種ECM成分，TIMP1是 MMP9的特異性抑制劑. 在健康個(gè)體，MMP9和TIMP1以1∶1的比例共同釋放. 而在哮喘發(fā)作時(shí)痰液中測(cè)得MMP9/ TIMP1比值增高［5］，表明在哮喘氣道重構(gòu)過程中，MMPs/TIMP表達(dá)失衡可能起到更為重要作用. 本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，各哮喘組均存在氣道重建，并且隨著激發(fā)時(shí)間加長(zhǎng)，豚鼠支氣管平滑肌厚度增厚，氣道重建的表現(xiàn)更加明顯. 哮喘發(fā)作時(shí)，MMP9升高，降解ECM，有利于炎癥細(xì)胞遷移至炎癥部分，同時(shí)MMP9降解的基質(zhì)片斷具有對(duì)炎癥細(xì)胞的趨化作用，促進(jìn)炎癥的進(jìn)一步發(fā)展；當(dāng)MMP9過度表達(dá)的同時(shí)，TIMP1也隨之升高以具有抑制MMP9的作用，并抑制ECM 的降解，而TIMP1的相對(duì)于MMP9的過度升高，最終導(dǎo)致MMPs/ TIMPs 比例平衡失調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂，促進(jìn)氣道重建的發(fā)生和發(fā)展. 而在這個(gè)過程中，MMP9和TIMP1之間變化決定氣道重建的具體過程. MMP9/TIMP1比例可以作為一種顯示哮喘氣道組織破壞和修復(fù)之間平衡的標(biāo)志［6］. 目前的研究結(jié)合本試驗(yàn)的結(jié)果，都證實(shí)該聯(lián)系的存在. 由此可見，MMP9及TIMP1在不同時(shí)期的過度表達(dá)以及二者表達(dá)的比例失衡，是支氣管哮喘氣道炎癥與重構(gòu)的重要機(jī)制之一，過度的MMPs表達(dá)與ECM 的降解有關(guān)，而TIMPs的過度上調(diào)，可能導(dǎo)致組織的異常修復(fù). 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示采取措施抑制MMP9的過度表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP9/TIMP1的平衡是防治哮喘氣道重構(gòu)的新策略.
參考文獻(xiàn)
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Clinical Effect Observation of 40 Wean's Gluteus Contracture through Operation
Key words:Operation; Glutells Contracture; Effect Observation
小兒臀肌攣縮癥是由臀肌及其筋膜的纖維變性攣縮繼發(fā)髖關(guān)節(jié)屈曲、內(nèi)收、內(nèi)旋功能障礙，患兒表現(xiàn)為特有的外八字步態(tài)和姿勢(shì)異常的臨床病癥。我院對(duì)本病均采用手術(shù)治療，術(shù)后功能鍛煉，無一例復(fù)發(fā)，有效率100％。本文對(duì)我院自1993年以來，收治的臀肌攣縮癥進(jìn)行總結(jié)報(bào)告如下。
1 臨床資料
1.1 一般資料 自1993年至2006年共收治小兒臀肌攣縮癥患兒40例，男28例，女12例，年齡4歲～17歲，平均年齡8歲。雙側(cè)對(duì)稱發(fā)病28例，雙側(cè)不對(duì)稱發(fā)病即一側(cè)重、一側(cè)輕12例。所收病例均有反復(fù)臀部肌肉注射史，注射藥物主要為青霉素、慶大霉素、安痛定等，所有病例均無家族史。
1.2 臨床表現(xiàn) 步態(tài)異常，行走時(shí)雙下肢呈輕度外展，外旋位，呈“外八字”狀，跑步時(shí)出現(xiàn)“跳步征”；站立時(shí)，雙下肢不能完全靠攏，輕度外旋，臀部尖削；坐立時(shí)，雙膝分開，不能靠攏，交腿征陽(yáng)性；雙膝并攏不能下蹲，髖關(guān)節(jié)屈曲近90°，屈髖受限，出現(xiàn)“劃圈征”或“蛙腿征”；髖部彈響，屈伸髖關(guān)節(jié)時(shí)，在股骨大粗隆表面有索帶滑過并產(chǎn)生彈響；臀部可觸及一條與臀大肌纖維走行方向一致的攣縮帶，當(dāng)髖關(guān)節(jié)內(nèi)收內(nèi)旋時(shí)更為明顯；骨盆X片，可見假性雙髖外翻，股骨頸干角＞130°；血液化驗(yàn)，如肌酐、肌酸均正常，無肌肉病表現(xiàn)。
1.3 手術(shù)方法 消毒雙側(cè)術(shù)區(qū)，術(shù)中根據(jù)需要，取患側(cè)臥位。切口取臀大肌前緣波狀切口，長(zhǎng)約10 cm，下至股骨大粗隆下2 cm止。顯露臀大肌筋膜，切除增厚的纖維化組織，繼之顯露臀大肌纖維攣縮條帶，將與周圍組織分開，于大粗隆上緣切除，如仍影響髖功能，應(yīng)松解髂脛束，必要時(shí)松解周圍肌肉，最后依次探查中、小肌如有纖維攣縮病變一并松解。術(shù)中要被動(dòng)活動(dòng)髖關(guān)節(jié)，屈髖90°無彈響為止。術(shù)中徹底止血，術(shù)后放置引流，加壓包扎。
1.4 術(shù)后功能鍛煉 術(shù)后置于屈髖屈膝90°位，雙膝并攏下肢交叉固定；術(shù)后2天拔出引流條，床上練習(xí)仰臥起坐；術(shù)后4天，下地扶床頭作蹲起活動(dòng)；術(shù)后傷口痛疼減輕，即作下地并膝行走；雙膝并攏固定2周，出院后功能鍛煉3個(gè)月。
2 療效標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果
根據(jù)功能障礙分級(jí)制定愈后標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)：步態(tài)雙下肢并攏下蹲及蹺二郎腿均正常；良：步態(tài)雙下肢并攏下蹲及蹺二郎腿基本正常；中：達(dá)臀肌攣縮功能障礙分級(jí)輕度；差：與術(shù)前比較無明顯改善，見表1。
表1 治療效果對(duì)比情況(略)
3 討論
3.1 發(fā)病原因 一般認(rèn)為臀肌攣縮癥系臀部肌肉注射后繼發(fā)的醫(yī)源性疾患，本院所收病例均有反復(fù)臀部肌肉注射史，也說明此點(diǎn)。任何注射劑均有刺激性，反復(fù)多次注射，可引起局部化學(xué)性炎癥，繼而發(fā)生纖維化、纖維組織增生，最后形成纖維痛瘢痕攣縮束帶，從而引起一系列癥狀及體征，由于雙側(cè)臀部接受肌肉注射的機(jī)會(huì)往往相等，故多雙側(cè)發(fā)病。
3.2 術(shù)中注意事項(xiàng) 所收病例術(shù)中發(fā)現(xiàn)病變范圍主要累及臀大肌的前下部分和闊筋膜張肌的后緣，但病變廣泛者可引起臀中肌變性、髖脛束或髖關(guān)節(jié)外旋肌、臀小肌、闊筋肌張肌等變性攣縮，偶見關(guān)節(jié)囊及皮膚皮下組織受累者。由于本病非手術(shù)治療無效，所以一旦確診，應(yīng)盡早采取手術(shù)治療，與以往手術(shù)切口不同，我們?nèi)⊥未蠹∏熬壊ㄐ吻锌凇Ｓ捎谕尾吭S多肌肉止于粗隆周圍，并且是肌肉筋膜病變最為嚴(yán)重的部位，因此，以股骨大粗隆為中心，使松解攣縮組織更為方便，并便于探查臀中、小肌。為正確判斷病情，術(shù)中應(yīng)注意正確的髖關(guān)節(jié)檢查，具體方法是，無論單側(cè)、雙側(cè)發(fā)病，均消毒雙髖、雙下肢皮膚，這樣在檢查一側(cè)髖功能時(shí)，便于防止對(duì)側(cè)髖、膝關(guān)節(jié)屈曲，固定骨盆，排除骨盆移位所致假象，并可進(jìn)行雙側(cè)對(duì)比，防止因兩側(cè)臀肌松解程度不一致而引起術(shù)后跛行及骨盆傾斜。若發(fā)現(xiàn)患側(cè)臀大肌、闊筋膜、髂陘束等攣縮組織松解后，髖關(guān)節(jié)在伸直位仍不能內(nèi)收時(shí)，應(yīng)考慮臀小肌受累的可能，這時(shí)首先探查臀中肌，有攣縮則予以松解，若無明顯病變，則將其向前牽引，顯露臀小肌，有變性，影響髖關(guān)節(jié)功能者，于大粗隆頂點(diǎn)徹底切斷臀小肌肌腱。術(shù)中應(yīng)注意保護(hù)坐骨神經(jīng)，防止誤傷，術(shù)后徹底止血，加壓包扎，防止血腫形成和發(fā)生感染。
3.3 術(shù)后早期功能鍛煉 可防止粘連，避免術(shù)后復(fù)發(fā)，提高整體療效，恢復(fù)關(guān)節(jié)的正常活動(dòng)度，是手術(shù)治療小兒臀肌攣縮不可缺少的組成部分。
參考文獻(xiàn)：
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摘 要：目的：從內(nèi)皮素(ET)、血栓素B2(TXB2)、6－酮－前列腺素F1α(6－keto－PGF1α)的角度說明射干麻黃糖漿治療豚鼠支氣管哮喘的機(jī)理。方法：選用荷蘭白種豚鼠，隨機(jī)分成4組，采用Barnes及呂寶璋方法進(jìn)行哮喘遣模，觀察各組豚鼠血漿中ET,TXB2、6－keto－PGF1α含量的變化。結(jié)果：氨茶堿組和射干麻黃糖漿組動(dòng)物血漿中ET、TXB2的含量低于模型組，6－keto－PGF1α的含量高于模型組。結(jié)論：射干麻黃糖漿是治療哮喘的有效方劑，其作用機(jī)理之一是提高血漿中ET,TXB2的含量和降低血漿中6－keto－PGF1α的含量。
關(guān)鍵詞：哮喘；射干麻黃糖漿；內(nèi)皮素(ET)；血栓素B2(TXB2)；6－酮－前列腺素F1α(6－keto－PGF1α)
中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673－7717(2007)07－1480－03
在我國(guó)，支氣管哮喘的患病率為1％－4％，并呈逐年增加的趨勢(shì)，其已成為嚴(yán)重威脅公眾健康的一種主要慢性疾病。
射干麻黃糖漿是以射干麻黃湯加上地龍、甘草等藥炮制而成，以《金匱要略》原文“咳而上氣，喉中水雞聲，射干麻黃湯主之”為理論基礎(chǔ)，用以指導(dǎo)治療發(fā)作期哮喘。本實(shí)驗(yàn)旨在通過對(duì)哮喘豚鼠血漿中ET、TXB2、6－keto－PGF1α含量的研究，探討射干麻黃糖漿治療哮喘的作用機(jī)理。
1 材料與方法
1．1 實(shí)驗(yàn)材料
1．1．1 動(dòng)物荷蘭白種豚鼠加只，雄性，體重(350±50)g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證書編號(hào)：遼實(shí)動(dòng)質(zhì)字[2000]019號(hào)。
1．1．2 療物中藥：射干麻黃糖漿，藥用：射干15g，麻黃8g，救冬花15g，細(xì)辛3g，紫菀15g，地龍15g，五味子15g，半夏15g，生姜15g，甘草15g，大棗6枚等12味。共4劑，常規(guī)煎煮成550mL的湯藥(即4mL湯藥中含有4g生藥)，再放入60％的糖和微量防腐劑制成射干麻黃糖漿。
西藥：氨茶堿片，赤峰制藥(集團(tuán))蒙欣藥業(yè)有限公司，內(nèi)衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1996)第000206，制成氨茶堿溶液，其含量為4mL溶液含0.015g氨茶堿。
1．1．3 試劑 蛋白片，上海化學(xué)試劑分裝廠，GB2756－81，批號(hào)92－11－28，購(gòu)于沈陽(yáng)醫(yī)藥股份有限公司。分別在使用前配成10％和1％的蛋白溶液。
1．1．4 試劑盒內(nèi)皮素(ET)、血栓素B2(TXB2)、6－酮－前列腺素F1α(6－keto－PGF1α)放免試劑盒，100規(guī)格，購(gòu)于北京北方生物技術(shù)研究所。
1．1．5 儀器設(shè)備霧化器DS－671，5mL針管100個(gè)，低溫高速離心機(jī)MR1822 1400r/min souan法國(guó)
1．2實(shí)驗(yàn)方法
1．2．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和飼養(yǎng)條件將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、模型組、氨茶堿組、射干麻黃糖漿組。每組10只，分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)安靜，自然光照，通風(fēng)良好，室溫20－26℃，濕度45％－65％，飼料為全價(jià)顆粒大鼠飼料和每日于市場(chǎng)購(gòu)買的新鮮胡蘿卜、大頭菜，墊料為干草，每2－3天換1次墊料并進(jìn)行室內(nèi)消毒。
1．2．2 造模方法及給藥，豚鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，熟悉環(huán)境后，進(jìn)行造模，除空白對(duì)照組外，其余3組均腹部注射新鮮配置的10％蛋白溶液1mL，空白對(duì)照組腹部注射1mL生理鹽水，14天后，除空白對(duì)照組通過霧化器用生理鹽水進(jìn)行噴霧激發(fā)無反應(yīng)外，其余3組均通過霧化器用新鮮配置的1％蛋白溶液進(jìn)行噴霧激發(fā)，直到出現(xiàn)煩躁、咳嗽、腹肌抽動(dòng)、鼻翼煽動(dòng)等癥狀，每日1次，于激發(fā)前灌胃，空白對(duì)照組和模型組給予4mL生理鹽水，射干麻黃糖漿組給予4mL射干麻黃糖漿(含4g生藥)，氨茶堿組給予4mL氨茶堿溶液(含0.015g氨茶堿)，并記錄各組噴霧激發(fā)到出現(xiàn)癥狀的時(shí)間。
1．3 取材和指標(biāo)檢測(cè)
配制新鮮的20％氨基甲酸乙酯溶液(即烏拉坦)，腹腔注射進(jìn)行麻醉，剖開胸腔，用一次性5mL注射器心臟穿刺取靜脈血2mL注入內(nèi)含10％EDTA二鈉3μL和抑肽酶40μL的潔凈試管中，混勻，4℃，3000r/min離心10min，分離血漿，于－70℃下保存，待測(cè)ET。取一次性5mL空針吸取消炎痛－EDTA?Na2液約0.1mL，快速靜脈穿刺取血5mL。即刻在空針顛倒混勻，注入試管內(nèi)，4℃，3500r/min離心15min，分離血漿，放-70℃下保存，待測(cè)TXB2和6－keto－PGF1α。檢測(cè)方法為免疫平衡法。
1．4統(tǒng)計(jì)方法
采用SPSS.11軟件進(jìn)行方差分析。
2 結(jié) 果
哮喘激發(fā)后豚鼠皮毛沒有激發(fā)前光滑、柔順，食量減少；在4組中，模型組從激發(fā)開始到出現(xiàn)癥狀的時(shí)間比氨茶堿組和射干麻黃糖漿組短，模型組哮喘的程度比氨茶堿組和射干麻黃糖漿組重；從豚鼠精神狀態(tài)看，氨茶堿組和射干麻黃糖漿組的豚鼠的精神狀態(tài)好于模型組，其食量也比模型組大。見表1－3。
3 討 論
3．1 射干麻黃糖漿的藥理作用
中醫(yī)認(rèn)為哮喘是宿痰內(nèi)伏于肺，遇誘因而引發(fā)，使痰阻氣道，肺失肅降，氣道攣急。射干麻黃糖漿中用射干降逆行氣，開肺化痰；麻黃、細(xì)辛發(fā)散風(fēng)寒于外，溫肺化飲于內(nèi)，止咳平喘；紫菀、款冬花下肺氣之逆，降氣化痰，半夏燥濕化痰，生姜和胃化痰，五味子收斂肺氣，恐劫散之藥，傷其正氣，以大棗和胃健脾。再加上地龍、甘草等增強(qiáng)平喘止咳，祛痰作用。諸藥共奏溫肺逐飲、化痰降逆、下氣平喘之功。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為哮喘是多種炎癥細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥，這種炎癥使氣道對(duì)各種激發(fā)因子產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性，同時(shí)引起氣道縮窄。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)：麻黃對(duì)支氣管平滑肌有松弛作用，麻黃中Ephedroxane有利于呼吸道炎癥的消退，麻黃水提物、醇提物能抑制過敏介質(zhì)釋放。射干具有抗炎、祛痰作用。細(xì)辛具有抗炎、抗變態(tài)及免疫抑制作用。地龍具有平喘作用，對(duì)支氣管具有顯著的舒張作用?？疃ā胂?、紫菀、五味子有鎮(zhèn)咳、祛痰作用，五味子同時(shí)對(duì)免疫功能有雙向調(diào)節(jié)作用。甘草具有具有增強(qiáng)免疫功能、抗過敏作用和平喘作用。生姜具有抗炎、鎮(zhèn)痛、松弛平滑肌作用。大棗具有抗變態(tài)反應(yīng)作用。此外，還有一些臨床報(bào)道，認(rèn)為射干麻黃湯可提高哮喘患者的肺功能，能降低血漿內(nèi)皮素、
血漿黏度水平。所以，從現(xiàn)代藥理的角度看。射干麻黃糖漿可以治療哮喘。
3．2血栓素B2(TXB2)6－酮－前列腺素F1α(6－keto－PGF1α)內(nèi)皮素(ET)作用
TXB2和6－keto－PGF1α是肺內(nèi)含有的TXA2、PGI2的代謝產(chǎn)物，其活性穩(wěn)定，TXA2對(duì)肺的血管和支氣管有強(qiáng)烈的收縮的作用，6－keto－PGF1α的生理作用與血栓素A2(TXA2)完全相反，有舒張肺血管的作用，并能抑制組胺及乙酰膽堿引起的支氣管平滑肌的收縮，缺氧時(shí)PGI2的作用更明顯。
ET在肺內(nèi)的廣泛分布于肺血管，呼吸道上皮，黏膜腺體和擬交感神經(jīng)節(jié)，在肺內(nèi)，小支氣管的含量最高。ET是已知最強(qiáng)的氣管和支氣管平滑肌收縮劑，一些實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用ET灌流肺，可以促進(jìn)TXA2釋放，ET對(duì)肺血管的收縮具有快慢兩個(gè)時(shí)相，第I相可能是ET直接作用的結(jié)果，第n相可能是繼發(fā)TXA2釋放引起的。研究證明，ET可以誘導(dǎo)PGF2，促進(jìn)糖蛋白的分泌，又可通過上皮細(xì)胞，產(chǎn)生PGI2，抑制黏膜腺體的分泌，前者是直接作用，后者是繼發(fā)效應(yīng)。ET除以上作用，還可促進(jìn)呼吸纖毛的擺動(dòng)，增加擺動(dòng)頻率，加強(qiáng)纖毛一黏液排送功能；它還能刺激肺泡巨噬細(xì)胞釋放花生四烯酸和TXB2，此外它對(duì)肺血管平滑肌和成纖維細(xì)胞亦有促進(jìn)增殖的作用。
可見，炎癥刺激可促進(jìn)ET、TXB2、6－keto－PGF1α的釋放，同時(shí)，此三者又可再刺激炎癥的產(chǎn)生，而三者本身也具有一定的相互作用，存在相互關(guān)聯(lián)。ET、TXB2都可使平滑肌收縮，6－keto－PGF1α可舒張平滑肌，因此三者在血漿中的值可以反應(yīng)射干麻黃糖漿治療哮喘的療效。
【摘要】 【目的】觀察穴位經(jīng)皮給藥藥貼對(duì)實(shí)驗(yàn)性哮喘豚鼠血清中環(huán)氧化酶2(cox2)水平的影響?！痉椒ā繉?8只豚鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、地塞米松組和經(jīng)皮給藥藥貼組，每組各12只。除正常對(duì)照組外，各組豚鼠均采用卵白蛋白致敏法復(fù)制實(shí)驗(yàn)性過敏性哮喘模型。經(jīng)皮給藥藥貼組采用大椎、肺俞、腎俞穴位貼敷治療，地塞米松組采用腹腔注射地塞米松05 mg/kg治療。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組豚鼠血清cox2水平，采用蘇木素—伊紅染色檢測(cè)各組豚鼠支氣管肺組織病理形態(tài)變化?！窘Y(jié)果】模型組豚鼠血清cox2水平顯著高于正常對(duì)照組(p<005)，經(jīng)皮給藥藥貼組、地塞米松組血清cox2水平顯著低于模型組(p<005)。模型組豚鼠支氣管肺組織出現(xiàn)明顯病理?yè)p害，經(jīng)皮給藥藥貼組支氣管肺組織僅出現(xiàn)輕度病理改變?！窘Y(jié)論】穴位貼敷經(jīng)皮給藥藥貼可能通過降低血清中cox2水平，從而對(duì)哮喘產(chǎn)生治療作用。
【關(guān)鍵詞】 經(jīng)皮給藥藥貼/治療應(yīng)用;支氣管哮喘/穴位療法;環(huán)氧化酶2/血液;疾病模型，動(dòng)物;豚鼠
哮喘是以多種炎癥基因表達(dá)增加或異常表達(dá)為特征，由多種炎癥細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)和氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞(上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等)及細(xì)胞組分(細(xì)胞因子、化學(xué)因子、黏附分子、酶類和受體)參與的一種氣道慢性炎癥性疾患[1]。WwW.133229.CoM環(huán)氧化酶2(cox2)是一種誘導(dǎo)酶，它能促進(jìn)細(xì)菌脂多糖、炎性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和腫瘤啟動(dòng)子的產(chǎn)生，與炎癥反應(yīng)及腫瘤發(fā)生相關(guān) [2] 。在哮喘的病理生理過程中cox2可能起了關(guān)鍵作用 [3] 。
近年來，應(yīng)用穴位貼敷療法治療哮喘的研究較多[4] ，經(jīng)皮給藥系統(tǒng)是藥物經(jīng)由皮膚吸收進(jìn)入人體血液循環(huán)，并達(dá)到有效血藥濃度、實(shí)現(xiàn)疾病治療或預(yù)防的一類貼劑(或貼片) [5] 。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)清代《張氏醫(yī)通》中記載的消喘膏加用麻黃為處方，利用現(xiàn)代藥物提純和經(jīng)皮給藥技術(shù)制作成一種藥貼，觀察穴位貼敷經(jīng)皮給藥藥貼對(duì)哮喘模型豚鼠血清cox2水平的影響，并探討其治療哮喘的療效機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。
1材料與方法
11實(shí)驗(yàn)藥物、儀器及試劑雞卵白蛋白(美國(guó)sigma公司，批號(hào)：a5253)由廣州市威佳科技有限公司提供，地塞米松注射液由廣州白云山制藥廠提供，經(jīng)皮給藥藥貼藥物質(zhì)量比為：白芥子∶麻黃∶延胡索∶甘遂∶細(xì)辛=2∶2∶2∶1∶1，由南方醫(yī)科大學(xué)中藥制劑實(shí)驗(yàn)室制備。wh22000型超聲霧化儀由廣東粵華公司生產(chǎn)，multiskan ii elisa檢測(cè)儀由芬蘭生產(chǎn)，ld42a型水平離心機(jī)由北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)，bx50生物組織顯微鏡由日本olympus公司生產(chǎn)，eg1140石蠟包埋機(jī)、tp1020生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、rm2050石蠟切片機(jī)均為德國(guó)徠卡公司產(chǎn)品，cox2酶聯(lián)免疫吸附(elisa)試劑盒由武漢博士德生物有限公司提供(產(chǎn)品編號(hào)為ek0603)。
12實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模48只成年豚鼠，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):0031706)。所有豚鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、經(jīng)皮給藥藥貼組和地塞米松組，每組各12只?？刂剖覝兀鹘M在相同條件下飼養(yǎng)，先將動(dòng)物飼養(yǎng)3 d適應(yīng)環(huán)境后開始造模。第4天，除正常對(duì)照組外，其他各組均采用雞卵白蛋白致敏，常規(guī)消毒后一次性腹腔注射100 g/l卵白蛋白生理鹽水1 ml，使豚鼠處于致敏狀態(tài)[6]。第18天開始，將致敏的豚鼠置于密閉透明的塑料盒內(nèi)，給予10 g/l卵白蛋白生理鹽水混懸液霧化吸入加以激發(fā)，每次30 s，1次/d，連續(xù)14 d，以腹式呼吸明顯，呼吸頻率加快且節(jié)律不整，活動(dòng)減少等癥狀為誘喘成功。正常對(duì)照組以生理鹽水代替卵白蛋白生理鹽水，其致敏及誘喘時(shí)間同造模組。
13治療方法于哮喘發(fā)作次日開始治療：地塞米松組采用腹腔注射地塞米松05 mg/kg，隔天治療1次，共治療7次。經(jīng)皮給藥藥貼組進(jìn)行穴位貼敷治療，穴位選擇：大椎穴、肺俞穴(雙)、腎俞穴(雙)[7]。具體方法：將豚鼠頸背部穴位處用寵物電剪刀剪毛，剪毛范圍：縱向大椎至腎俞，橫向脊柱兩側(cè)各旁開15 cm，用大塊膠布將藥物敷貼固定于穴位處。每次敷藥6 h，治療時(shí)間與次數(shù)同地塞米松組。模型組造模成功后令其自然恢復(fù)，正常對(duì)照組不給予任何干預(yù)治療。
14樣本制備在末次誘喘后2～4 h內(nèi)，給豚鼠稱體質(zhì)量，用30 g/l戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔注射麻醉豚鼠，迅速斷頭取血，每只取5 ml，室溫放置2 h后，3 000 r/min離心15 min，取上清液，放冰箱-20 ℃保存待測(cè)。同時(shí)迅速打開胸腔，暴露肺及心臟，常規(guī)取支氣管肺組織，避免鉗夾組織引起組織受壓影響觀察，取材部位：右中下肺取一橫切面，包括肺門。所取組織經(jīng)100 g/l多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋和切片(厚4 μm)待測(cè)。
15檢測(cè)方法采用elisa法定量檢測(cè)各組豚鼠血清中cox2水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明的方法和要求操作。采用光鏡觀察各組經(jīng)蘇木素—伊紅(he)染色切片的支氣管肺組織形態(tài)變化。
16統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在spss 130上建立數(shù)據(jù)庫(kù)、進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入與統(tǒng)計(jì)分析。各組間差異采用單向方差分析(oneway anova)，方差齊用lsd檢驗(yàn)，方差不齊用tamhanes檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=005。
2結(jié)果
21動(dòng)物數(shù)量實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，共剩豚鼠30只，每組隨機(jī)取6只，共24只納入結(jié)果分析。
22各組豚鼠血清cox2水平比較表1結(jié)果顯示：模型組豚鼠血清cox2水平顯著高于正常對(duì)照組(p<005)，經(jīng)皮給藥藥貼組、地塞米松組血清cox2水平顯著低于模型組(p<005)。
23各組支氣管肺組織形態(tài)觀察結(jié)果正常對(duì)照組支氣管黏膜上皮完整，平滑肌無明顯的增厚，肺泡壁清晰完整，間隔形態(tài)正常，無明顯的炎癥細(xì)胞表1各組豚鼠血清cox2水平比較(x±s)浸潤(rùn)。模型組支氣管管壁黏膜上皮細(xì)胞受損和脫落明顯，氣道壁不完整，黏膜下層炎癥明顯，氣道平滑肌增厚，膠原纖維增加，管腔狹窄，氣道腔內(nèi)黏液分泌增多，黏液栓堵塞，氣道周圍嗜酸性粒細(xì)胞明顯增加，肺泡內(nèi)可見彌漫性慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)、管腔變窄，肺泡基本上實(shí)變，充滿炎癥細(xì)胞，有肺大泡形成，肺泡間隔有明顯充血。地塞米松組支氣管黏膜上皮基本完整，管壁平滑肌層有輕度的增厚，間質(zhì)炎癥細(xì)胞較少，肺泡間隔基本完整，腔內(nèi)有少量的炎癥細(xì)胞，肺泡間隙輕度充血以及有少數(shù)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)皮給藥藥貼組支氣管的黏膜上皮基本完整，平滑肌層有輕度的增厚，管周有少量的炎癥細(xì)胞，肺泡完整，間質(zhì)輕度充血，結(jié)果見圖1(彩圖見第317頁(yè))。
3討論
支氣管哮喘(哮喘)是當(dāng)今世界最常見的慢性疾病，其病理生理改變以氣道慢性非特異性炎癥、氣道反應(yīng)性增高及氣道重建為主要特征，三者相互作用、互相影響 [8] 。
哮喘的治療目前國(guó)內(nèi)外首選消除非特異炎癥的糖皮質(zhì)激素，但由于副作用大、成癮性強(qiáng)及易反復(fù)發(fā)作等缺點(diǎn)的存在，使其有效應(yīng)用受到一定限制。穴位敷貼治療哮喘則是在傳統(tǒng)中醫(yī)針灸理論指導(dǎo)下發(fā)揮其獨(dú)特療效的 [9] 。 穴位敷貼給藥為一古老的中醫(yī)外治法，具有不經(jīng)消化系統(tǒng)破壞和肝臟分解，維持較長(zhǎng)時(shí)間且穩(wěn)定的血藥濃度，從而使藥物作用時(shí)間長(zhǎng)而穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。而且由于穴位給藥，藥物成分通過經(jīng)絡(luò)感傳影響多層次的生理功能，它們之間可能產(chǎn)生相互激發(fā)和協(xié)調(diào)作用，導(dǎo)致生理上的放大效應(yīng)，使藥物的外治效果可能優(yōu)于內(nèi)服 [10-11] 。本實(shí)驗(yàn)光鏡觀察到的結(jié)果從病理角度驗(yàn)證了穴位貼敷經(jīng)皮給藥藥貼治療豚鼠哮喘的有效性。
哮喘的本質(zhì)是炎性反應(yīng)，來自體液直接反映炎癥存在情況的細(xì)胞因子或炎癥介質(zhì)成為近年來的研究重點(diǎn)，如炎性反應(yīng)環(huán)節(jié)中起著關(guān)鍵作用的cox2，已被視為快速炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志之一 [12] 。 cox2主要存在于氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，生理狀態(tài)下它幾乎不被表達(dá)，只有在炎性細(xì)胞因子或炎性介質(zhì)將細(xì)胞激活的情況下才被表達(dá)[13]。哮喘患者氣道黏膜中有大量的單核—巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，被激活后可產(chǎn)生大量的cox2，cox2是一種炎性酶，它的表達(dá)可誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，如前列腺素e2(pge2)、白細(xì)胞介素6(il6)、il8、il18等，這些炎癥介質(zhì)又加重了炎癥反應(yīng)，從而誘發(fā)哮喘或使哮喘加重，而且cox2的過度表達(dá)與氣道重塑和氣道氣流阻塞程度加重有關(guān) [14-17] 。
本研究結(jié)果顯示，模型組豚鼠血清cox2水平顯著高于正常對(duì)照組(p<005)，表明cox2的表達(dá)與哮喘的發(fā)作密切相關(guān)。經(jīng)皮給藥藥貼組、地塞米松組血清cox2水平顯著低于模型組(p<005)，說明地塞米松與經(jīng)皮給藥藥貼均可能是通過影響cox2的表達(dá)而對(duì)哮喘發(fā)作產(chǎn)生治療作用。
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【摘 要】探討千佛菌對(duì)H22(肝癌)小鼠免疫功能的影響。方法：觀察各組Mφ、IL- 1含量,分別采用吞噬中性紅比色法、MTT 比色法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果: 荷瘤小鼠模型組與正常組比較, Mφ吞噬功能、IL- 1含量均顯著降低( P
【關(guān)鍵詞】千佛菌; Mφ吞噬功能; IL- 1活性; H22
千佛菌是一種藥食兩用的真菌類植物,具有很好的保健作用和很高的藥用價(jià)值。賀新懷教授等研究發(fā)現(xiàn)［1-2］,千佛菌能提高腎陽(yáng)虛小鼠和荷S180 肉瘤小鼠的免疫功能, 改善小鼠腎陽(yáng)虛癥狀,抑制 S180肉瘤生長(zhǎng)。本文以荷H22小鼠為研究對(duì)象, 探討千佛菌對(duì)Mφ吞噬功能和IL- 1產(chǎn)生的影響。
1材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
千佛菌購(gòu)自陜西省鎮(zhèn)安縣千佛菌種植基地。
1.1.1藥液制備: 取千佛菌干品500g經(jīng)蒸餾水洗滌后,加10倍量的蒸餾水,煎煮2次,每次30min,合并濾液,分成 2 份,分別濃縮至每毫升溶液相當(dāng)于原藥材 1g( 1: 1)、2g( 2: 1),置于4℃?zhèn)溆谩?/p>
1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 健康昆明種小鼠,雌雄各半,18-20g,4-6 周齡。購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.1.3瘤株:H22瘤株由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.1.4主要試劑: RPMI- 1640培養(yǎng)液購(gòu)于Gibco 公司。LP S、ConA 購(gòu)
于 Sigma 公司。MTT為Flrka公司產(chǎn)品。10% 活性小牛血清、PBS 購(gòu)于華美生物公司。DMSO 國(guó)產(chǎn)分析純,購(gòu)于成都化學(xué)試劑廠。
1.1.5主要儀器: 超凈工作臺(tái),倒置顯微鏡,CO2恒溫培養(yǎng)箱,酶標(biāo)儀,電子天平, 離心機(jī),24及96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1動(dòng)物分組、模型制備及用藥: 將昆明種小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、千佛菌小劑量組、千佛菌大劑量組四組。除正常對(duì)照組外,其余三組皮下接種 H22瘤細(xì)胞懸液,制成小鼠荷瘤模型。然后千佛菌小劑量組、千佛菌大劑量組分別用 1: 1( 相當(dāng)于原藥材 1g/ ml)、2: 1( 相當(dāng)于原藥材2g/ ml) 濃度的千佛菌溶液灌胃 1m l, 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水。各組均灌胃1次/d, 連續(xù) 14d。于第15天處死動(dòng)物檢測(cè)指標(biāo)。
1.2.2腹腔Mφ吞噬功能的測(cè)定:取各實(shí)驗(yàn)組小鼠,按文獻(xiàn)［3］制備腹腔Mφ,濃度為 2×107/ml,加入 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 100μl/孔,每樣品二孔,37℃ ,5% CO2條件下培養(yǎng)2h,吸去未貼壁細(xì)胞,加入無菌 0.075% 中性紅溶液( pH7.2,用 PBS 配制),100μl/孔,混合培養(yǎng)15min,去上清, PBS洗三遍,加入 DMSO 100μl/孔,4℃過夜,待溶解后,酶標(biāo)儀530nm處測(cè)定OD值。
1.2.3IL- 1活性測(cè)定:取健康昆明種小鼠,按文獻(xiàn)［3,4］制備胸腺細(xì)胞,以含 2.5 μg/mlConA,10%小牛血清的 RBM R-1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ ml,加入96孔板,100 μl/孔,做5個(gè)平行孔,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72h, 1500r/ min 離心10min,去上清,以不完全培養(yǎng)液洗滌3次,以完全 1640培養(yǎng)液重新調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ ml,加入96孔板, 100μl/孔, 做5 個(gè)平行孔。按文獻(xiàn)［3,4］制備貼壁Mφ,加入含小牛血清10% , LPS10μg/ ml 的 RPMI - 1640 培養(yǎng)液10μl/孔,繼續(xù)培養(yǎng)24h,吸獲上清,做1:8,1:16兩個(gè)稀釋度,加入含有正常胸腺細(xì)胞的培養(yǎng)板,100μl/孔,每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行孔, 并設(shè)陰性對(duì)照和絲裂原對(duì)照。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24h, 加入MTT液10μl/孔,加入DMSO,100μl/孔,振蕩混勻3min,待溶解后,酶標(biāo)儀 530nm處測(cè)OD值。
1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示, 采用方差齊性檢驗(yàn), t 檢驗(yàn)。
2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 千佛菌對(duì)荷瘤小鼠腹腔Mφ吞噬功能的影響: 見表 1。
表1 千佛菌對(duì)荷瘤小鼠腹腔Mφ吞噬功能的影響（x±s）
組別 n Mφ吞噬中性紅后細(xì)胞溶解OD值 P 值
空白對(duì)照組 10 0.5206±0.0589
模型對(duì)照組 8 0.3781±0.0311 < 0. 01
千佛菌小劑量組 10 0.4312±0.04557 > 0. 05
千佛菌大劑量組 10 0.4752±0.06886 < 0. 01
結(jié)果表明: 模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較, Mφ吞噬功能明顯降低(P< 0. 01)。大、小劑量組與模型對(duì)照組相比, Mφ吞噬功能有不同程度的改善,其中小劑量組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著差異,而大劑量組與模型對(duì)照組相比呈顯著差異(P
2.2千佛菌對(duì)荷瘤小鼠腹腔Mφ產(chǎn)生的IL- 1的影響: 見表 2
表 2千佛菌對(duì)荷瘤小鼠腹腔Mφ產(chǎn)生 IL- 1的影響（x±s）
組別 n Mφ培養(yǎng)上清 OD值
1: 8 P值 1: 16 P值
空白對(duì)照組 10 0. 5199±0. 0074 0. 4323±0.0688
模型對(duì)照組 8 0. 2759±0. 0322 < 0. 01 0. 2520±0.0030 < 0. 01
佛菌小劑量組 10 0. 3599±0. 0489 < 0. 05 0. 3011±0.0324 < 0. 05
千佛菌大劑量組 10 0. 4011±0. 0499 < 0. 01 0. 3122±0.0268 < 0. 01
結(jié)果表明:模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較,腹腔Mφ產(chǎn)生IL- 1的能力顯著降低( P< 0.01),大劑量組與模型對(duì)照組比較呈極顯著差異(P
2.3結(jié)論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:千佛菌可顯著增強(qiáng)荷H22小鼠腹腔Mφ吞噬功能,提高M(jìn)φ分泌IL-1的水平。
3討論
在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中,巨噬細(xì)胞是一種多功能的免疫細(xì)胞，在機(jī)體的非特異性免疫與特異性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著非常重要作用。表現(xiàn)在，巨噬細(xì)胞可通過氧依賴性途徑和氧非依賴途徑清除殺傷病原體;通過分泌眾多趨化因子與促炎癥細(xì)胞因子參與和促進(jìn)炎癥反應(yīng);是專職的抗原提呈細(xì)胞,啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答;活化的巨噬細(xì)胞還可分泌多種細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)［5］。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL- 1是啟動(dòng)抗菌炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子,還可以參與到免疫調(diào)節(jié)中。
本研究結(jié)果說明,千佛菌能提高荷H22小鼠的Mφ的吞噬功能及IL- 1的產(chǎn)生作用。肝癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤。機(jī)體免疫力低下是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因，而千佛菌可提高機(jī)體免疫功能，其抑瘤效應(yīng)可通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來研究。
參考文獻(xiàn)
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［4］ 譚允育, 游麗芬, 徐元景, 等. 大補(bǔ)陰丸對(duì)正常小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］ 中國(guó)實(shí)驗(yàn)臨床免疫學(xué)雜志,1999; 11( 2) : 21- 22.
【摘要】 目的 通過逆轉(zhuǎn)錄-DNA聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)豚鼠哮喘模型氣管上皮內(nèi)皮素-1（ET-1）mRˉNA表達(dá)，檢測(cè)哮喘患者氣管上皮內(nèi)皮素-1（ET-1）和內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶（ECE）mRNA表達(dá)。方法 （1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:Hartley株豚鼠用卵蛋白腹腔注射致敏，霧化吸入激發(fā)，提取氣管上皮細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，PCR擴(kuò)增DNA。（2）臨床實(shí)驗(yàn)部分:設(shè)對(duì)照組和哮喘組。一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增β-actin片段、ET-1片段和ECE片段。PCR產(chǎn)物的鑒定和半定量。計(jì)算ET-1/β-actin值和ECE/β-actin值。結(jié)果 （1）動(dòng)物模型檢測(cè):在電泳緩沖液內(nèi)，紫外燈下可見ET-1為333bp左右條帶，與標(biāo)記DNA條帶相對(duì)應(yīng)。（2）臨床實(shí)驗(yàn):哮喘組ET-1mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。哮喘組ECEmRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無顯著性（P>0.05）。結(jié)論 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)出卵蛋白致敏激發(fā)的豚鼠氣管上皮細(xì)胞ET-1mRNA表達(dá)。哮喘患者支氣管粘膜ET-1mRNA表達(dá)明顯增高，而ECEmRNA表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無顯著性。
關(guān)鍵詞 RT-聚合酶鏈反應(yīng) 內(nèi)皮素-1 內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶
【Abstract】 Objective To detect the mRNA expressions of endothelin-1in tracheal epithelium cell from guinea pig asthma model by reverse transcriptional polymerase chain reaction，to detect the mRNA expressions of enˉdotheline-1and endothelin converting enzyme in tracheal epithelium cell from asthma patient.Methods （1）Animal experiment department:sensitize the guinea pig by inject ovi-protein into the abdominal cavity，excitation by aspirate the ovi-protein solutions，extract RNA from tracheal epithelium cell，reverse transcribe the RNA to cDNA，amplify DNA by polymerase chain reaction.（2）Clinical department:laying the asthema group and the control group，extract RNA from tracheal epithelium cell，reverse transcribe the RNA to cDNA，amplifyβ-actin、ET-1and ECE fragment by polymerase chain reaction.evaluate and semi-quantify the PCR product，calculate ET-1/β-actin and ECE/β-actin.Results （1）Animal experiment:we can see the ET-1is about a333bp strap in the electrophoresis solution under the infrared lamp，correspond with the marking strap.（2）Clinical department:The mRNA expressions of enˉdothelin-1of the asthema group is great high than the control group（P<0.05），the difference of mRNA expressions of ECE is not significant at two groups（P>0.05）.Conclusion It can detect the mRNA expressions of endothelin-l in tracheal epithelium cell from guinea pig asthma model by reverse transcriptional polymerasechain reaction.The mRNA expressions of endothelin-1of the asthema group is great high than the control group，The differece of mRNA expressions of ECE isnot significant at two groups.
Key words reverse transcriptional-polymerase reaction endothelin-1 endothelin converting enzyme
內(nèi)皮素-1（ET-1）是至今所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)烈的支氣管平滑肌收縮物質(zhì)之一，并有促進(jìn)成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖，以及促進(jìn)粘膜下腺體分泌的作用 ［1］ 。研究發(fā)現(xiàn)ET-1參與哮喘的發(fā)病和發(fā)展 ［2，3］ ，哮喘患者和動(dòng)物模型的血漿 ［4］ 或氣管上皮ET-1水平明顯增高 ［5］ 。研究豚鼠哮喘模型氣管上皮細(xì)胞ET-1mRNA表達(dá)的測(cè)定方法有助于進(jìn)一步闡明支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制，迄今尚未見有關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過逆轉(zhuǎn)錄-DNA聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)豚鼠哮喘模型氣管上皮ET-1水平 ［6］ ，現(xiàn)報(bào)告如下。
1 對(duì)象與方法
1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分 （1）對(duì)象:健康Hartley株豚鼠（復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供）共16只，體重200～250g，雌雄不拘。（2）主要儀器設(shè)備和試劑:DNA TRERMAL CYCLER480型自動(dòng)PCR儀（PERKIN ELMER CETUS），CSD-L型超靜臺(tái)（上海凈化設(shè)備廠），DY-A型電泳儀（上海生化工程研究所基巴斯公司），BF-300紫外線檢測(cè)儀（四星公司），ALARM-1000型高速低溫離心機(jī)（計(jì)田公司），37型霧化吸入器（ARI公司），擴(kuò)增引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶及有關(guān)試劑購(gòu)于上海試劑廠、上海基因公司、上?；倒?。（3）方法:①動(dòng)物模型的建立:用10%卵蛋白溶液按100mg/kg，約0.2～0.25ml，對(duì)豚鼠行腹腔內(nèi)注射致敏，2周后用1%卵蛋白溶液3ml霧化吸入，每次1min，每天1次共3次，激發(fā)豚鼠。②提取氣管上皮細(xì)胞RNA:脫頸椎處死豚鼠，75%乙醇頸部皮膚消毒，剪開并固定皮膚，取出氣管，刮凈氣管外膜，用生理鹽水沖洗，置消毒平皿，攜入超靜臺(tái)，剪開氣管，加Trizol ［8］ 液1ml，用Tip頭刮取氣管上皮，并吹打至無團(tuán)塊，移入1.5ml EP管中，室溫放5min，加0.3ml氯仿，用力晃搖1min，室溫放3min，低溫離心12000r/min×15min，將無機(jī)相移入新EP管中，加0.5ml異丙醇，室溫放5min，低溫離心12000r/min×20min，去上清液，加1ml75%乙醇洗管，加1ml100%乙醇，放入冰箱-70℃保存。③逆轉(zhuǎn)錄將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA:將保存RNA的EP管低溫離心10000r/min×10min;去上清液，加20μl DEPC水置于冰上，吸取4μg RNA液，加DEPC水稀釋至12μl;加1μl Randon Prine，置70℃水浴×10min;加RT mix:Buffer5μl、dNTP2.5μl、M DTT2.5μl、RNase inhibitor1μl、M-MLV RTase1μl，置40℃水浴×1h，置95℃水浴×5min;加GOOD WATER35μl至60μl:-20℃保存。（4）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增DNA ［7］ :取cDNA液5μl、GOOD WATER35μl、Buffer5μl、Mgcl 2 2μl、引物各1μl、dNTP0.5μl、Taq酶0.5μl;94℃水浴×2min（94℃水浴×1min63℃水浴×2min72℃水浴×2min，共5個(gè)循環(huán)）（94℃水浴×1min60℃水浴×1min72℃水浴×1min，共30個(gè)循環(huán)）72℃水浴×7min。
1.2 臨床實(shí)驗(yàn)部分
1.2.1 對(duì)象 對(duì)照組10例，平均年齡（41±9）歲;哮喘組10例，平均年齡（38±7）歲，實(shí)驗(yàn)前3個(gè)月未應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療。兩組均為男性。
1.2.2 方法 （1）在電子纖維支氣管鏡直視下，鉗取右中間支氣管粘膜活組織3～5塊。（2）根據(jù)一步法提取總RNA。（3）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:取總RNA約1～5μg，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上?；蚬荆┖铣蒫DNA。（4）PCR擴(kuò)增cDNA:由上海生化工程公司合成以下引物:①肌動(dòng)蛋白（β-actin）:上游:5′ATGTGGCACCACACCTTCTACATGAGCTGCG3′下游:5′CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC3′用此對(duì)引物擴(kuò)增出838bp的β-actin片段。②ET-1引物:上游:5′AACˉCATGGATTATTTGTCCATG3′下游:5′AGTGTTGACCˉCAAATGATGTCC3′用此對(duì)引物擴(kuò)增出230bp的ET-1片段。③ECE引物:上游:5′AGCGTGAGCGAGGCAGAGAG3′，下游:5′GGGGTAGAAGATGGTGTTGA3′，用此對(duì)引物擴(kuò)增出567bp的ECE片段。④PCR反應(yīng)條件:ET-1:92℃1min42℃2min72℃3min，共35循環(huán)。加強(qiáng)延伸:72℃10min。ECE:94℃1min59℃2min72℃1min，共35循環(huán)。加強(qiáng)延伸:72℃7min。（5）PCR產(chǎn)物的鑒定和半定量:反應(yīng)完成后，取1～5μl PCR反應(yīng)液進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察，可見ET-1為230bp條帶、ECE為567bp條帶、β-actin為838bp條帶。在紫外凝膠圖像分析儀上進(jìn)行熒光度測(cè)定，計(jì)算ET-1/β-actin值和ECE/β-actin值。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間顯著性差異檢驗(yàn)采用配對(duì)t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 動(dòng)物模型檢測(cè)結(jié)果 在2%瓊脂糖內(nèi)加入0.5μg/ml的溴化乙錠（EB），在加樣孔內(nèi)加入待測(cè)DNA與標(biāo)記DNA，放入電泳儀，在電泳緩沖液內(nèi)，電壓80mV下電泳20～30min，放在紫外燈下觀察，可見ET-1為333bp左右條帶，與標(biāo)記DNA條帶相對(duì)應(yīng) ［9］ 。
2.2 臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果 兩組均有ET-1和ECEmRNA的表達(dá)。哮喘組ET-1mRNA表達(dá)量（ET-1/β-actin值為0.81±0.04）明顯高于對(duì)照組（0.11±0.02），P<0.05。哮喘組ECEmRNA表達(dá)量（ECE/β-actin值為0.33±0.25）與對(duì)照組（0.32±0.12）比較差異無顯著性，P>0.05。見表
1。
表1 哮喘組ET-1和ECE mRNA的表達(dá) （略）
關(guān)鍵詞 經(jīng)皮穿刺內(nèi)窺鏡下胃造瘺術(shù) 康復(fù)護(hù)理 吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練 中、重度吞咽功能障礙
中圖分類號(hào)：R473.6； R493 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1006-1533（2013）05-0018-05
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，40%～73%的腦血管病患者會(huì)發(fā)生不同程度的吞咽功能障礙[1]。腦血管病和顱腦外傷導(dǎo)致的吞咽功能障礙表現(xiàn)為飲水嗆咳、吞咽困難，常導(dǎo)致吸入性肺炎、甚至窒息死亡。因此，如何解決和改善社區(qū)康復(fù)護(hù)理中的患者的中、重度吞咽功能障礙意義重大。本研究采用前瞻性研究方法，觀察社區(qū)中中樞性中、重度吞咽功能障礙患者在經(jīng)皮穿刺內(nèi)窺鏡下胃造瘺術(shù)（percutaneous endoscopic gastrostomy， PEG）后胃腸營(yíng)養(yǎng)方式下[2-3]接受12周系統(tǒng)、規(guī)范的康復(fù)護(hù)理和吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練的效果，以探討規(guī)范的康復(fù)護(hù)理聯(lián)合吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練對(duì)改善中樞性吞咽功能障礙患者的功能狀態(tài)的影響及意義。
1 對(duì)象
本文觀察對(duì)象為于2010年1月1日至2012年4月30日間在復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)中心住院并接受康復(fù)治療的中、重度吞咽功能障礙患者，系在社區(qū)中臨床診出的新發(fā)腦血管意外或顱腦外傷患者并已經(jīng)顱腦CT或磁共振成像檢查結(jié)果的確診。
1）入選標(biāo)準(zhǔn)：首次發(fā)病的腦血管病或顱腦外傷患者；病程為發(fā)病后4周～24個(gè)月；意識(shí)清醒；愿意簽署知情同意書；年齡在18～80歲間；有中、重度的吞咽功能障礙（《洼田飲水試驗(yàn)》評(píng)分4～5分）。
2）排除標(biāo)準(zhǔn)：活動(dòng)性肝病或肝、腎功能不全患者；充血性心力衰竭患者；惡性腫瘤患者；惡性進(jìn)行性高血壓患者；癡呆患者；呼吸功能衰竭患者；昏迷者；首次發(fā)病4周以內(nèi)或大于24個(gè)月患者；既往有腦血管病或顱腦外傷史且遺留吞咽困難癥狀者；原有其他疾患導(dǎo)致吞咽困難者；居住外地?zé)o法隨訪者；既往有精神病史患者；聾、啞人；拒絕簽署知情同意書者。
本研究得到復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的認(rèn)可。
2 方法
2.1 康復(fù)護(hù)理
2.1.1 PEG術(shù)前的康復(fù)護(hù)理
PEG置管前應(yīng)進(jìn)行術(shù)前心理疏導(dǎo)，取得患者及其家屬的理解和配合，同時(shí)注意患者的情緒，給予適當(dāng)?shù)陌参亢凸膭?lì)，消除患者對(duì)病情及手術(shù)的疑慮和悲觀情緒。術(shù)前8 h起需禁食、禁水[3-4]。
2.1.2 PEG術(shù)后的康復(fù)護(hù)理要點(diǎn)
PEG術(shù)后應(yīng)在患者的護(hù)理記錄中記下置入體內(nèi)的造瘺管的品牌、型號(hào)、管徑和長(zhǎng)度以及置管醫(yī)師的緊急聯(lián)系方式。置管后6～8 h內(nèi)應(yīng)監(jiān)測(cè)患者的各項(xiàng)生命體征（意識(shí)、脈搏率、呼吸和血壓）。這些參數(shù)可以提示有無出血、特別是內(nèi)出血。術(shù)后6～8 h內(nèi)造瘺管可連接引流袋，注意觀察引流袋內(nèi)容物的顏色和量，如顏色見紅、量多要及時(shí)告知醫(yī)師。術(shù)后24 h～1周內(nèi)應(yīng)每天消毒造瘺創(chuàng)口處、更換敷料，觀察造瘺口周圍皮膚有無發(fā)紅、出血、腫脹、硬結(jié)和過敏反應(yīng)等，同時(shí)輕輕旋動(dòng)造瘺管外固定裝置180°，確保PEG管至少有5 mm的移動(dòng)空間，避免其與創(chuàng)面擠壓過緊而導(dǎo)致創(chuàng)面缺血或發(fā)生“包埋”綜合征。術(shù)后48 h內(nèi)造瘺管固定應(yīng)較緊以防出血，以后可稍放松以防止皮下組織缺血壞死，但需固定好以防止胃內(nèi)容物滲漏入腹腔；術(shù)后2周后因竇道形成，可適當(dāng)放松。不應(yīng)在置管后10 d內(nèi)去除造瘺管，而須在胃腹壁竇道形成后才能將管去除。8～10個(gè)月后可用內(nèi)窺鏡檢查造瘺管內(nèi)側(cè)管口的狀況及位置[2-9]。
術(shù)后要根據(jù)醫(yī)囑適當(dāng)給予抗生素治療3～5 d，同時(shí)積極祛痰、經(jīng)靜脈補(bǔ)足液體量。
2.1.3 術(shù)后營(yíng)養(yǎng)供給與給藥護(hù)理
術(shù)后6～8 h內(nèi)禁水、禁食，防止誤吸和嗆咳。術(shù)后喂養(yǎng)宜在置管后6～8 h后開始，最好在24 h后滴入營(yíng)養(yǎng)液；管飼喂養(yǎng)前后至少要用25～30 ml的無菌生理鹽水或滅菌水沖洗管道，且應(yīng)至少每8小時(shí)沖洗1次以防止管道堵塞。營(yíng)養(yǎng)液的配制應(yīng)選用易被腸道吸收的營(yíng)養(yǎng)物，原則上以高熱量、高蛋白、高纖維素及微量元素為主，如“能全力”營(yíng)養(yǎng)液等。營(yíng)養(yǎng)液的滴入應(yīng)遵循先慢后快、先薄后濃、先少后多的原則。瓶裝腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液懸掛滴注的時(shí)間不應(yīng)超過8 h；袋裝營(yíng)養(yǎng)液懸掛滴注的時(shí)間不應(yīng)超過24 h。竇道形成后每天的營(yíng)養(yǎng)液可使用50 ml注射器推注，每2～3小時(shí)供給1次（從早晨6：30～晚上21：30），每次可推注入200～300 ml（不要超過400 ml），推注時(shí)間應(yīng)大于10 min，推注前后要用25～30 ml的無菌生理鹽水或滅菌水沖洗管道，而營(yíng)養(yǎng)液的溫度以保持37～40 ℃為宜。管飼時(shí)患者應(yīng)采用30°～45°半坐臥位，這有利于食物進(jìn)入小腸；管飼結(jié)束后應(yīng)保持半坐位30 min，以避免返流。每當(dāng)連接新的一袋（瓶）腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液（勻漿）或?qū)艿朗欠裎挥谡Ｎ恢糜袘岩蓵r(shí)都應(yīng)使用pH試紙來確定管道的位置，pH應(yīng)
術(shù)后6～8 h后可以給藥，但要確認(rèn)給予的所有藥物必須是液體或可研磨成細(xì)的粉末并與凈水混勻，可用注射器抽取藥液并推入管道；每次給藥前后都要用25～30 ml的無菌生理鹽水或滅菌水沖洗管道。對(duì)不宜（易）碾碎使用的緩、控釋片劑和膠囊藥物以及較易引起管道堵塞的藥物，建議少用或以針劑替代[4-5]。
2.1.4 術(shù)后沐浴護(hù)理
患者可在置管24～48 h后或7～10 d后經(jīng)醫(yī)師復(fù)查確認(rèn)無異常后再淋浴。造瘺口完全愈合后，造瘺口周圍皮膚用肥皂水清洗就可，但沖洗前需去掉敷料，徹底沖洗以祛除殘留的肥皂水并保持局部皮膚干燥[5-6]。
2.1.5 防止導(dǎo)管堵塞的護(hù)理
當(dāng)營(yíng)養(yǎng)液輸注速度很慢或沖洗管腔有阻力時(shí)，可能系營(yíng)養(yǎng)液或藥物在管壁沉積、使導(dǎo)管堵塞所致。此時(shí)可以用30 ml溫?zé)醿羲疀_洗管腔并用50 ml注射器及時(shí)反復(fù)抽吸，以促使管腔內(nèi)沉積物或凝結(jié)塊松脫[4-6]。
2.1.6 防止導(dǎo)管脫落（斷裂）和拔管時(shí)的護(hù)理
PEG置管后，如護(hù)理不當(dāng)，偶可出現(xiàn)導(dǎo)管脫落或斷裂。此外，因臨床治療安全性需要或患者吞咽功能恢復(fù)良好，也需要拔管。為預(yù)防導(dǎo)管脫落或斷裂，應(yīng)妥善固定導(dǎo)管，在導(dǎo)管上做好標(biāo)記以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管脫出；另外，可在患者衣服上縫個(gè)小孔，導(dǎo)管從孔中穿出，用膠布或夾子將導(dǎo)管相對(duì)固定在衣服上，避免牽拉、折疊和彎曲導(dǎo)管以及由于導(dǎo)管晃動(dòng)或牽拉等而引起患者不適或疼痛。一旦出現(xiàn)導(dǎo)管脫落或斷裂，要及時(shí)施行PEG置管更換術(shù)?；颊咄萄使δ芑謴?fù)良好需拔管時(shí)，應(yīng)使用內(nèi)窺鏡于胃腔取出造瘺管蘑菇頭。拔管后用凡士林紗布加壓覆蓋瘺口，2～3 d后即可愈合，但拔管后需禁食24 h[4-8]。
2.1.7 護(hù)理中應(yīng)觀察的其他異常問題
在對(duì)患者的康復(fù)護(hù)理過程中，要勤于觀察和記錄，同時(shí)還可能發(fā)現(xiàn)以下異常情況：①造瘺管管口周圍皮膚出現(xiàn)紅、腫、疼痛、滲液或有膿液等現(xiàn)象；②管口有血液滲出或大便發(fā)黑或有紅色血液，考慮內(nèi)出血可能；③導(dǎo)管滑出、插入深度變淺或皮膚出處刻度改變2 cm以上；④管口局部出現(xiàn)肉芽組織；⑤患者出現(xiàn)8 h以上的反復(fù)嘔吐或持續(xù)24 h以上的惡心或腹瀉、或胃腸積氣或積液24 h以上，影響營(yíng)養(yǎng)液或勻漿的攝入；⑥便秘3 d以上或大便干結(jié)5 d以上；⑦體重1周內(nèi)下降1 kg以上或增加1 kg以上、或出現(xiàn)眼瞼和（或）足踝水腫；⑧出現(xiàn)原因不明的發(fā)熱或虛弱。如在護(hù)理過程中發(fā)現(xiàn)上述異常情況，護(hù)理人員應(yīng)該及時(shí)與主管醫(yī)師聯(lián)系和溝通，從而及時(shí)查明原因、提出切實(shí)可行的解決辦法，避免發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥[2-9]。
2.1.8 出院回社區(qū)后的護(hù)理指導(dǎo)
患者病情改善后可以帶著PEG置管回家，但需指導(dǎo)患者及其家屬切實(shí)掌握造瘺管的護(hù)理及其技能：①應(yīng)選用新鮮、高營(yíng)養(yǎng)、溫度適宜的流質(zhì)或半流質(zhì)食物并制成勻漿以利消化，避免過于油膩、過冷、過熱或過硬的食物；②推注用品應(yīng)保持清潔；③指導(dǎo)推注的速度、量和溫度，推注前后應(yīng)用溫開水沖洗管腔，每次推注入食物后應(yīng)讓患者坐起30 min以防返流致管腔堵塞；④指導(dǎo)患者休息、活動(dòng)或沐浴時(shí)應(yīng)將造瘺管固定在胸腹壁上，尤其是在沐浴后應(yīng)該保持造瘺口皮膚干燥；⑤指導(dǎo)患者及其家屬在出現(xiàn)問題時(shí)及時(shí)與相關(guān)醫(yī)務(wù)人員取得聯(lián)系。長(zhǎng)期置管后PEG管會(huì)出現(xiàn)老化或滲漏，一般半年到2年需在原位更換造瘺管[5-6]。
2.2 吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練
社區(qū)中的中、重度中樞性吞咽功能障礙患者在同意接受PEG并簽署知情同意書后通過聯(lián)系消化內(nèi)窺鏡診治中心、由急救車轉(zhuǎn)診至消化內(nèi)窺鏡診治中心施行PEG，術(shù)后病情平穩(wěn)后再轉(zhuǎn)診返回社區(qū)康復(fù)病房，開始接受規(guī)范的康復(fù)護(hù)理和吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練?；颊呓邮芸祻?fù)醫(yī)院自制的營(yíng)養(yǎng)均衡勻漿以保證營(yíng)養(yǎng)和熱量，同時(shí)接受為期12周的吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練。其中，前8周每周指導(dǎo)訓(xùn)練5次、每次30 min，后4周每周指導(dǎo)訓(xùn)練1次、每次30 min；其余時(shí)間指導(dǎo)患者家屬或護(hù)工進(jìn)行康復(fù)護(hù)理和輔助吞咽功能訓(xùn)練。吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練的具體內(nèi)容主要包括吞咽功能基礎(chǔ)訓(xùn)練、進(jìn)食訓(xùn)練、部分聯(lián)合間接訓(xùn)練方法和代償策略[9-12]。隨訪過程中如患者出現(xiàn)吸入性肺炎且體溫大于38.5 ℃并持續(xù)2～3 d，則暫停吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練。
2.3 主要觀察指標(biāo)及評(píng)定方法
采用《洼田飲水試驗(yàn)》評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[13]，對(duì)每例患者在入選時(shí)（w0）以及入選2周后（w2）、4周后（w4）、8周后（w8）和12周后（w12）的臨床吞咽功能分別進(jìn)行測(cè)評(píng)，同時(shí)記錄患者的身高、體重、吸入性肺炎和PEG置管相關(guān)并發(fā)癥情況等相關(guān)指標(biāo)。
3 結(jié)果
10例患者于發(fā)?。?.2±5.5）個(gè)月后入選，其中腦血管病7例、腦外傷3例，男6例、女4例，平均年齡為（43.2±16.8）歲，入選前共計(jì)發(fā)生過23人次的吸入性肺炎。無病例失訪。10例患者在w0、w2、w4、w8和w12時(shí)的《洼田飲水試驗(yàn)》評(píng)分均分分別為5.0、4.7、3.9、3.1和2.4分，在w2、w4、w8和w12時(shí)的《洼田飲水試驗(yàn)》評(píng)分平均改善值分別是0.3、1.1、1.9和2.6分；在w0、w2、w4、w8和w12時(shí)的平均體重指數(shù)分別為20.32、20.29、20.45、20.74和21.04，在w12時(shí)的平均體重和體重指數(shù)分別改善2.1 kg和0.72（表1）。
在整個(gè)隨訪期，僅有1例患者因吞咽功能改善而成功拔除了PEG置管，但共發(fā)生5人次肺部感染、1例PEG造瘺管管口輕度感染、1例PEG術(shù)后胃出血、2人次因PEG造瘺管內(nèi)置蘑菇頭脫落至十二指腸球部而堵塞腸管、1次造瘺管外部橡皮管斷裂。
4 討論
中、重度吞咽功能障礙常見于腦血管病和顱腦外傷患者，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。因此，如何對(duì)社區(qū)中的中、重度吞咽功能障礙患者進(jìn)行康復(fù)護(hù)理和吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練、提高其生存質(zhì)量是社區(qū)康復(fù)護(hù)理工作應(yīng)予重點(diǎn)關(guān)注的問題之一[14]。
對(duì)經(jīng)臨床治療后病情穩(wěn)定且意識(shí)清醒、但若采用補(bǔ)償性吞咽手法或通過改進(jìn)食物性狀等方法仍然不能經(jīng)口獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)和水的腦血管病和顱腦外傷患者，PEG是一種較好的經(jīng)導(dǎo)管輸入胃腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)方式[2-4，15-16]。本研究觀察了在PEG這種胃腸營(yíng)養(yǎng)方式下的康復(fù)護(hù)理和吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練效果。
本研究采用《洼田飲水試驗(yàn)》評(píng)分、體重和體重指數(shù)等相關(guān)指標(biāo)來衡量患者在康復(fù)護(hù)理和吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練前后的相關(guān)功能和指標(biāo)變化。從患者各階段的《洼田飲水試驗(yàn)》評(píng)分以及12周后的體重和體重指數(shù)的改善值可以看出，規(guī)范的康復(fù)護(hù)理聯(lián)合吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練能夠明顯改善患者的吞咽功能。
然而，因PEG置管這種胃腸營(yíng)養(yǎng)方式在國(guó)內(nèi)應(yīng)用不多且多用于危重患者或在重癥監(jiān)護(hù)室內(nèi)應(yīng)用，故相關(guān)醫(yī)務(wù)人員、患者家屬和護(hù)工對(duì)PEG造瘺管的管理和護(hù)理都缺乏相應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)。在本研究過程中，由于研究團(tuán)隊(duì)的醫(yī)護(hù)人員也有一個(gè)從最初不了解PEG置管相關(guān)康復(fù)護(hù)理知識(shí)到逐步熟悉的過程，所以在研究初期出現(xiàn)了1例PEG造瘺管管口輕度感染、2人次因PEG造瘺管內(nèi)置蘑菇頭脫落至十二指腸球部所致腸管堵塞以及在研究中期出現(xiàn)了1次造瘺管外部橡皮管斷裂。通過提高康復(fù)護(hù)理人員的造瘺管管理和護(hù)理水平，這些現(xiàn)象可相應(yīng)減少、甚至完全避免。
PEG置管后的康復(fù)護(hù)理相當(dāng)重要。對(duì)康復(fù)護(hù)理人員（包括醫(yī)師、護(hù)士和護(hù)工）甚至患者家屬和患者本人普及基本的PEG置管后的護(hù)理要點(diǎn)、營(yíng)養(yǎng)和藥物供給方法、沐浴護(hù)理等康復(fù)護(hù)理知識(shí)非常重要，能夠幫助避免術(shù)后并發(fā)癥的出現(xiàn)[16-18]。例如，本研究中的2人次PEG造瘺管內(nèi)置蘑菇頭脫落至十二指腸球部所致腸管堵塞就是由于護(hù)理人員沒有及時(shí)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管皮膚處刻度改變2 cm以上引起的，而造瘺管外部橡皮管斷裂也是由于護(hù)理人員沒有按照營(yíng)養(yǎng)供給前后應(yīng)常規(guī)以25～30 ml凈水沖洗、導(dǎo)致管腔堵塞和護(hù)工在每次給予藥液或營(yíng)養(yǎng)液后都會(huì)折疊橡皮管并用橡皮筋固定而最終導(dǎo)致管子折斷引起的。這些異常情況在加強(qiáng)康復(fù)護(hù)理后均未再發(fā)生。
此外，在本研究初期有1例患者在造瘺術(shù)后出現(xiàn)了胃出血并發(fā)癥，但因康復(fù)護(hù)理人員發(fā)現(xiàn)較早并及時(shí)采取了處理措施，未導(dǎo)致嚴(yán)重后果。另外，在PEG置管營(yíng)養(yǎng)方式下，由于免除了上呼吸道和消化道刺激以及胃賁門口處于自然開合狀態(tài)，患者的吸入性肺炎發(fā)生次數(shù)減少、僅發(fā)生了5人次的吸入性肺炎，有利于患者的吞咽功能康復(fù)訓(xùn)練，也有利于患者的吞咽功能恢復(fù)[19-23]。
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