干細胞培養(yǎng)技術精選(九篇)

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第1篇：干細胞培養(yǎng)技術范文

【摘要】

目的 建立Wistar大鼠骨髓間充質干細胞（MSCs）分離、培養(yǎng)的方法，并進行鑒定、標記。方法 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠的MSCs。采用相差顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)學特征；流式細胞儀檢測第3代細胞表面標志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表達率；電鏡檢查第3代MSCs超微結構。DAPI標記MSCs為下一步進行體內細胞移植示蹤。結果 原代培養(yǎng)的MSCs于6～8 h后貼壁，6 d左右形成集落，14 d 左右可達到80%～90%融合。第3代細胞表面標記物CD29，CD44，CD34和CD45的陽性率分別為98.6 %，78.2%，0.0%，0.3%。超微結構清晰，可見細胞器，如線粒體、粗面內質網(wǎng)和高爾基復合體，細胞核呈圓形或不規(guī)則，可見較多微絨毛。DAPI可良好標記MSCs細胞核，呈藍色熒光。結論 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法能夠成功分離和培養(yǎng)大鼠的MSCs，在第3代可獲得高純度MSCs。DAPI可以作為一種示蹤劑標記MSCs。

【關鍵詞】 細胞培養(yǎng)；間充質干細胞；種子細胞；示蹤劑

【Abstract】 Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) from Wistar rats in vitro，and to identify characteristic of the cells and to label them after culture expansion.Methods MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of Wistar rats by adherent method.The morphology of MSCs was observed under phase contrast microscope.The expression of CD29 ， CD44 ， CD34 and CD45 of the third generation cells were analyzed by flow cytometry. Electron microscopic features were also observed and MSCs were labeled by DAPI. Results After 6 to 8 h primary culture ， MSCs adhered to plastic surface of the culture dish. 　About 6 d later ， the cells proliferated in colonies.Primary MSCs reached 80%～90%of confluence in 14 d approximately.The positive rates of CD29 ， CD44 ， CD34 ， and CD45 in MSCs at third generation were 98.6% ，78.2% ，0.0% ， and 0.3% respectively. Under the electron microscope MSCs had plentiful cytoplasm with mitochondria rough endoplasmic reticula and Golgi complexes.Their nuclei were round or irregular and there were plenty of microvilli on the surface. All of the MSCs after labeling by DAPI showed blue fluorescence by fluoroscope.Conclusions Mesenchymal stem cells can be successfully isolated and cultivated by adherent method.And higher purity MSCs can be picked up after culture expansion at P3. DAPI can be an effective tracer agent to label MSCs.

【Key words】 Cell culture;Mesenchymal stem cells;Seed cells; Tracer agent

骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細胞，可以向骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、干細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞以及心肌細胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于體外擴增，因其來源充足、取材方便，體外增殖能力相對較強，而且在異體移植中排斥反應小，被認為是組織工程和基因工程的理想種子細胞，為心血管疾病、神經(jīng)疾病和骨關節(jié)疾病的治療提供了一條全新的治療方案。本文在總結貼壁分離法培養(yǎng)MSCs的基礎上，優(yōu)化MSCs純化、鑒定、標記的方法，以獲得穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，為應用組織工程技術提供大量的種子細胞。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級雄性Wistar大鼠(3周鼠齡，60～70 g)，吉林大學動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑和藥品

低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，特級胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，亞美尼亞倉鼠抗大鼠CD29Alexa Fluor (Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45過氧化物酶（FITC）(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD44PE (Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠CD34FITC(Santa Cruz公司)，46二脒基2苯基吲哚（DAPI）儲存液(Sigma 公司)。

1.3 分離和培養(yǎng)

Wistar大鼠麻醉后處死，浸泡酒精15 min，無菌條件下分離股骨、脛骨，無血清DMEM沖洗骨髓腔，取混懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混懸，將獲得的細胞接種在100 ml培養(yǎng)瓶中，5% CO2，37℃下培養(yǎng)24～48 h，換液，去除未貼壁細胞，2～3 d更換一次培養(yǎng)基，光鏡觀察細胞融合情況，細胞80%融合后傳代，0.25%胰酶消化，用血球計數(shù)儀計數(shù)細胞、傳代，培養(yǎng)3～5代細胞。

1.4 透射電鏡樣品制備

將培養(yǎng)3代10 cm2培養(yǎng)皿中約2×106個細胞以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，再以3 %戊二醛4℃固定1 h，送電鏡室，脫水包埋并制作超薄切片，行透射電鏡觀察并拍照。

1.5 MSCs表面標記物檢測

0.25%胰酶消化收獲第3代細胞，收集1×106個細胞，洗滌1次，0～4℃預冷的70%乙醇1 ml邊加入邊搖勻，混勻后置于4℃冰箱待進行細胞表面標記物檢測。檢測時以1 ml PBS洗滌2次，加含10%山羊血清的 PBS常溫孵育10 min，1 000 r/min離心5 min去上清，與飽和濃度的CD29Alexa Fluor、CD34FITC、CD44PE、CD45FITC單克隆抗體及其同型對照混勻，室溫下閉光反應30 min，PBS 洗滌細胞，置于冰上，行流式細胞儀檢測。

1.6 MSCs標記

將無菌的DAPI 儲存液加入培養(yǎng)的MSCs爬片上清中，至終濃度為50 mg/L ，37 ℃孵育染色至少30 min。細胞至少用Hanks 平衡鹽溶液沖洗6 遍以除去未結合的DAPI。熒光顯微鏡下觀察細胞爬片。

2 結 果

2.1 MSCs相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)

骨髓細胞接種于培養(yǎng)瓶后，約6～8 h可見MSCs細胞貼壁，呈圓形或多角形，換液后，貼壁細胞清晰可見，2～3 d后可見少量短梭形、星形細胞分散貼壁生長，伸出偽足呈逗點狀或短棒狀；6 d左右可見放射狀排列的細胞集落，伸出長短不一、粗細不均的突起、胞核大、核仁清晰。約14 d細胞融合80%～90%，呈漩渦狀。傳代細胞比原代細胞貼壁快，24 h內已全部貼壁、伸展，增殖迅速，均勻分布生長，3～4 d可見長梭形細胞80%～90%鋪滿培養(yǎng)皿形成單層。見圖1。

2.3 MSCs的鑒定及標記

第3代細胞表面標記物CD29、CD44、CD34和CD45的陽性率分別為98.6 %、78.2%、0.0%、0.3%。見圖3。細胞經(jīng)DAPI標記后，細胞核呈藍色。見圖4。

3 討 論

由于骨髓的細胞組成復雜，細胞功能各異，其中MSCs含量很低，約為骨髓低密度組分中有核細胞的0.001%～0.01%〔3〕，故分離高純度的MSCs是原代培養(yǎng)關鍵性技術。目前，獲得MSCs的方法主要有貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀分離法、免疫磁珠分選法〔4〕。而骨髓貼壁法操作步驟簡單，既降低了離心對細胞的損害，又減少了污染機會，且分離的MSCs貼壁時間短，增殖快，細胞數(shù)量多，經(jīng)傳代后能夠純化，提示全骨髓貼壁法是一種更加簡單有效的MSCs分離方法。

一般認為，間充質干細胞沒有特異性表面抗原，整合素家族成員CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等是MSCs的重要標志物〔5〕，而MSCs不表達造血細胞表面抗原，如造血前體細胞標志抗原CD34、成熟造血細胞標志抗原CD38、白細胞標志抗原CD45、淋巴細胞表面抗原CD11a和單核細胞/巨噬細胞表面抗原CD14。因此，實驗選取MSCs表達陽性的指標CD29、CD44，以及表達陰性的指標CD34和CD45作為鑒定參考指標〔2，6〕。本研究選擇了CD29、CD34、CD44和CD45進行檢測，結果表明培養(yǎng)的細胞CD29和CD44陽性，CD34和CD45陰性，符合MSCs的特點，經(jīng)過傳代，第三代可獲得較高純度的MSCs，可以作為穩(wěn)定的種子細胞進行體內研究。

DAPI是一種能夠與DNA強力結合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測。DAPI對活細胞無毒性，不改變細胞器的超微結構，熒光保持時間較長。移植細胞的標記是研究其在體內的定位不可缺少的，目前常用的標記法有DAPI標記法、溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標記法、染色體標記法、基因標記法。BrdU法存在只能標記增殖期細胞，且標記細胞不能直接觀察等不足。染色體標記主要將雄性供體動物細胞移植到雌性動物體內，通過Y染色體雜交區(qū)別確認移植細胞。其優(yōu)點在于可以終生標記，但也存在操作繁瑣，無法觀察活細胞等不足?；驑擞浄ㄍㄟ^基因轉染或直接從轉基因動物取材，使被標記細胞攜帶綠色熒光蛋白（GFP）暼報告基因。但目前，實現(xiàn)報告基因在目的細胞中高效穩(wěn)定表達仍然存在程序繁瑣、實驗周期長、成功率低等困難，而從轉基因動物取材又因為動物來源困難，在國內較少開展〔7〕。本研究表明，DAPI起初標記率很高(接近100%)，1 w內可維持80%～90%標記率。但隨著標記時間的延長，其標記效率迅速下降，3 w以后絕大多數(shù)細胞失去標記。

本實驗完善貼壁法建立Wistar大鼠MSCs培養(yǎng)體系，經(jīng)鑒定細胞純度高，可以為體內移植提供大量的種子細胞。采用DAPI 進行細胞標記后，熒光顯微鏡下見所有MSCs 均已被標記藍色熒光，提示DAPI 標記法敏感性好，標記效率高，可應用進行體內細胞移植的良好標記。

參考文獻

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第2篇：干細胞培養(yǎng)技術范文

【摘要】 目的研究柴胡皂苷-d（SS-d）對乙醇損傷大鼠原代培養(yǎng)肝細胞保護的作用和機制。方法采用胰蛋白酶消化、分離大鼠肝細胞進行原代培養(yǎng)，乙醇體外誘導肝細胞損傷，以不同濃度的SS-d對肝細胞保護，檢測培養(yǎng)液中丙氨酸氨基轉移酶（ALT）活性和肝細胞內丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性，MTT法檢測肝細胞存活率。結果SS-d（1.0，2.0，3.0mg·L－1）明顯改善肝細胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，對肝細胞中MDA含量升高和GSH-px活性降低均有明顯的抑制作用。結論SS-d對乙醇損傷大鼠肝細胞有保護作用，其機制可能與SS-d清除自由基、抑制質脂過氧化作用有關。

【關鍵詞】 乙醇 肝細胞 原代培養(yǎng) 柴胡皂苷-d 保護作用 機制

隨著人們生活水平的提高和飲酒量的增加，酒精對肝臟的損害日漸突出。了解酒精對肝損傷的機制，篩選有效預防和治療酒精性肝損傷的藥物應用于臨床，是亟待解決的重要課題。目前，中藥復方對酒精性肝損傷的實驗研究和報道比較多，單味制劑報道較少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中藥柴胡的有效成分，根據(jù)其化學結構不同可分為柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS-d)藥理活性作用最強。整體水平研究表明柴胡皂苷對酒精性肝損傷有預防作用［1］。本文建立體外乙醇損傷肝細胞模型，在細胞水平上進一步研究柴胡有效成分SS-d對乙醇損傷肝細胞的保護作用機制。

1 器材與方法

1.1 藥品與試劑 SS-d（純度98%），昆明長春花科技有限公司提供，臨用前以蒸餾水配制；Hanks液高壓滅菌，4℃保存；1.0 g·L－1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，過濾除菌，調pH 7.2，分裝，-30℃保存；基礎培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)基10.0 g，用超凈水900 ml溶解，5.6%NaHCO3調pH至7.2，定溶到1 000 ml，過濾除菌，臨用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml－1，鏈霉素100 μg·ml－1，胰島素5 μg·ml－1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-px測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 動物 SD大鼠，2～4 d齡乳鼠，雌雄不限，清潔級，承德醫(yī)學院實驗動物管理中心提供。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自動生化分析儀（美國Bayer公司），721W微機型分光光度計（上海光學儀器五廠），離心機（TGL.16G 上海）。

1.4 肝細胞分離培養(yǎng)［2］取新生2～4 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后斷頭放血，無菌分離肝臟，去除肝臟外膜及其周圍結締組織，置Hanks液中，灌注沖洗肝臟至灰白色，將肝臟剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊，用Hanks沖洗數(shù)次，除去血細胞，加入0.8g·L－1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入數(shù)滴血清終止消化，用滴管輕吹打成細胞懸液，經(jīng)200尼龍篩網(wǎng)過濾后用培養(yǎng)液洗2次，1 000 r離心5 min，收集肝細胞，臺盼藍活細胞計數(shù)>85%，按1 ×109個·L-1接種于鋪有鼠尾膠原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液去除血細胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進行分組實驗。

1.5 乙醇誘導肝細胞損傷模型的建立將含肝細胞培養(yǎng)液的96孔板，設正常對照組及乙醇25，50，75，100 mmol ·L－14個劑量組，肝細胞懸液與不同濃度乙醇繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)液按賴氏法測定ALT活性，MTT法測定肝細胞存活率。

1．6 MTT法選擇SS-d的實驗濃度 SS-d初濃度為5 mg/L，采用細胞培養(yǎng)液進行稀釋，依次為5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L－1。將肝細胞接種于96孔板培養(yǎng)72 h更換培養(yǎng)液，換用SS-d稀釋液培養(yǎng)，另設空白對照組，12 h后吸出培養(yǎng)液，各孔加入0.05%MTT200 μL，37℃孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亞砜200 μl，混勻以溶解被還原的MTT結晶，檢測波長為492 nm的光密度值，計算藥物不同稀釋濃度下細胞的存活率。

1.7 SS-d對乙醇誘導肝細胞損傷的保護作用取培養(yǎng)72 h肝細胞，設乙醇損傷模型組、SS-d(1 .0，2 .0，3.0mg·L－1)3個劑量保護組、正常對照組，每組設8個復孔。模型組和SS-d組加入乙醇100 mmol·L－1，同時SS-d組加入不同濃度的SS-d，正常對照組加不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集培養(yǎng)上清液檢測ALT活性，收集肝細胞檢測MDA含量和GSH-px的活性，MTT法測定肝細胞的存活率。

1.8 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)以 表示，用SPSS計算機軟件進行統(tǒng)計學分析， 組間比較采用t檢驗，P

2 結果

2.1 乙醇對原代培養(yǎng)肝細胞的損傷不同濃度的乙醇作用于肝細胞，對細胞有劑量依賴性的損傷作用，25 mmol·L－1作用不明顯，光鏡下細胞形態(tài)基本正常，隨著濃度的增大，肝細胞存活率呈進行性降低，反映肝細胞損傷的酶ALT逐漸升高；鏡下觀察肝細胞損傷明顯，細胞結構不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol ·L－1乙醇作用最明顯，我們選擇乙醇濃度為100 mmol ·L－1制備肝細胞損傷模型。見表1。表1 不同濃度乙醇對肝細胞ALT水平及細胞存活率的影響 與空白對照組比較#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

2.2 SS-d 實驗濃度的選擇SS-d不同濃度時細胞存活率見表2，為避免藥物濃度過大所致的細胞毒性作用，應選擇對細胞生長無明顯影響即肝細胞存活率在90%以上的濃度(1.0 ，2.0 ，3.0 mg·L-1)作為實驗所用藥物濃度。見表2。表2 不同濃度SS-d對肝細胞存活率的影響與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

2.3 SS-d對乙醇損傷肝細胞的保護作用 100 mmol·L－1乙醇作用肝細胞后，肝細胞損傷明顯，大量細胞壞死，細胞內ALT釋放量明顯升高，細胞內MDA含量明顯增高，GSH-px活性明顯下降；而給予SS-d保護后， 培養(yǎng)液中ALT水平明顯降低；肝細胞MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高；并且肝細胞存活率明顯升高。具有明顯的劑量依賴性(P＜0.05，P＜0.01)。表明：SS-d能夠保護肝細胞、穩(wěn)定肝細胞膜的結構，其保護作用可能與抗脂質過氧化作用有關。見表3。表3 SS-d對乙醇損傷肝細胞ALT，MDA，GSH-px水平與對照組比較，*P＜0.01，與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

3 討論

大量研究表明，乙醇對肝細胞損傷是通過自由基介導脂質過氧化作用進行的［3～5］。乙醇在肝臟代謝時產(chǎn)生大量自由基，自由基除直接損傷肝細胞外，可引起肝細胞膜發(fā)生脂質過氧化反應，使細胞膜和細胞器結構破壞，膜流動性失常，大量肝內酶（ALT，AST）釋放入血，并可抑制抗氧化劑谷胱甘肽的合成，減弱抗氧化酶（GSH-px）的抗氧化能力，使肝細胞代謝紊亂，肝功能異常，肝細胞廣泛脂肪樣和空泡樣變性，最終導致細胞腫脹死亡［6］。因此，清除自由基抑制脂質過氧化反應，才能保護肝細胞，恢復肝細胞結構和功能的完整性。

SS是柴胡的主要成分，研究表明，SS對實驗性肝損傷具有明顯的保護作用［7，8］。但對單體SS－d保肝作用研究報道較少。因此，我們利用乙醇制備體外肝細胞損傷模型，在細胞水平上對SS-d保肝作用機制進行探討。本研究顯示，模型組肝細胞培養(yǎng)液中ALT活性明顯升高，肝細胞脂質過氧化反應產(chǎn)物MDA含量增加，GSH-px活性降低，細胞存活率明顯下降，表明乙醇可引起肝細胞氧化損傷；給予SS－d保護后，和模型組比較，肝細胞培養(yǎng)液中ALT活性明顯較低，MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高，肝細胞存活率亦有明顯升高。提示，SS-d對乙醇損傷肝細胞有明顯保護作用，其機制可能是：①SS-d能增強機體內抗氧化防御能力，抑制自由基的產(chǎn)生；②穩(wěn)定肝細胞膜系統(tǒng)，提高膜結構的穩(wěn)定性，促進肝細胞增殖，防止肝細胞損傷和壞死。

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第3篇：干細胞培養(yǎng)技術范文

近日，英國倫敦帝國學院（Imperial College London）的科學家成功地利用人類胚胎干細胞培養(yǎng)出了軟骨細胞，這為在將來某一天進行軟骨移植提供了很好的契機。

研究結果發(fā)表在《組織工程》雜志中，文章詳細闡述了帝國學院研究小組將胚胎干細胞變成軟骨細胞的過程。這樣，醫(yī)生將可培養(yǎng)軟骨細胞并將其移植到許多受損或患病的組織中，即使因運動產(chǎn)生的損傷也可用新的軟骨取而代之，甚至是進行整容手術。

軟骨（Cartilage）是骨間非常密集的結締組織，允許關節(jié)之間進行平滑的移動。

文章的第一作者Archana Vats博士說：“利用干細胞培養(yǎng)軟骨的技術在臨床研究中具有巨大的應用價值。目前英國的老齡化問題越來越嚴重，長壽不可避免地成為備受關注的話題。在此之前，醫(yī)生也能進行關節(jié)移植，卻不能移植軟骨。而更換軟骨后就可以避免再對關節(jié)進行移植?！?/p>

研究人員在特定系統(tǒng)實驗室的有蓋培養(yǎng)皿中培養(yǎng)人類胚胎干細胞，進而促使其變成軟骨細胞。與生長中的胚胎干細胞相比，在干細胞與軟骨的混合物中存在較高含量的膠原質和軟骨蛋白。

科研人員將這些胚胎干細胞移植到老鼠體內的特定生物活性部位，之后進行了35的觀察。當干細胞脫離活性部位后，研究人員發(fā)現(xiàn)這些細胞形成了新的軟骨，研究結果顯示這些軟骨還可以被成功移植到活體組織中去。

第4篇：干細胞培養(yǎng)技術范文

【關鍵詞】 膠質瘤；細胞培養(yǎng)；應用

據(jù)統(tǒng)計大約9%的人類腫瘤是腦腫瘤，而腦腫瘤中90%是膠質瘤［1］。腦膠質瘤是來源于神經(jīng)上皮的腫瘤。在成人致命原發(fā)腦腫瘤中，高級別惡性膠質瘤最常見，確診后中位生存期為9~12個月［2］，而且這些患者是經(jīng)過積極治療的，包括外科切除、放療、化療等。這些治療的失敗部分歸咎于膠質瘤細胞侵襲性生長以及與周圍正常腦組織交錯，因而外科手術難以完全切除［3］；同時由于其異常的生物學特性，對放、化療的抗拒，導致術后放、化療失敗；而且經(jīng)常以同級別或高級別復發(fā)［4］。因此需要開辟新的治療方法如生物治療以及開發(fā)新的治療藥物，這些新的治療方法及新藥研制都需要以實驗為依據(jù)。目前關于膠質瘤的常用研究方法有臨床實驗和基礎實驗。其中常用的基礎實驗有細胞實驗以及動物實驗。細胞學實驗是基礎，是利用培養(yǎng)的細胞進行實驗，從細胞水平、分子水平揭示膠質瘤的細胞特性。它具有許多優(yōu)點：可以長時間直接觀察細胞的形態(tài)結構和生命活動［5］；研究的條件可以人為控制；研究的樣本比較均一；研究的內容便于觀察、檢測和記錄；可以用于許多領域的研究；相對而言比較經(jīng)濟。

1 膠質瘤細胞培養(yǎng)的歷史

1925年，F(xiàn)ish培養(yǎng)人惡性膠質瘤細胞獲得成功，開創(chuàng)了體外研究膠質瘤的先河。Manuelidis 于1959年建立的世界上第1個人膠質瘤細胞株TC178，使體外長期連續(xù)動態(tài)觀察膠質瘤細胞成為可能。 20世紀70年代以來，隨著基礎培養(yǎng)技術的迅猛發(fā)展，膠質瘤細胞的體外培養(yǎng)和克隆技術日趨成熟。近年來更是探索出許多新的培養(yǎng)方法，并應用于各項研究。

目前膠質瘤的細胞培養(yǎng)技術比較成熟，已經(jīng)建立了許多膠質瘤品系，如國內的人腦惡性膠質瘤體外細胞系SHG-44，是1980年取材于額葉星形細胞瘤的組織塊經(jīng)胰酶消化，單層靜止培養(yǎng)而成的；細胞形態(tài)有星形、梭形；流式細胞光度儀測定，此細胞以四倍體為主，G1期占54.57%、S期占15.17%、G2/M期占30.25%；免疫組化提示本細胞中存在S-100和GFAP；存于蘇州大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科細胞實驗室。已經(jīng)明確的膠質瘤細胞系（株）有許多，有人型、鼠型等，如U251、U87、U118、T98、TJ899、TJ905、D54、NT325、CHG5、BT325、9L、C6等，而且今后還會不斷建立新的品系。

2 目前常用培養(yǎng)方法及應用

現(xiàn)有的膠質瘤細胞培養(yǎng)形式主要有：單層細胞培養(yǎng)、三維/立體培養(yǎng)及聯(lián)合培養(yǎng)等。

2.1 單層細胞培養(yǎng)及應用 傳統(tǒng)意義上的單層細胞培養(yǎng)可以分為原代培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)兩類。前者是從供體獲得組織后的初次培養(yǎng)，后者一般為利用現(xiàn)有的細胞系（株）。

兩種培養(yǎng)方法各有優(yōu)缺點，而且都已經(jīng)得到廣泛的應用。目前國內研究膠質瘤的實驗多采用細胞系，這主要是因為國內已經(jīng)有許多膠質瘤細胞系，品系明確、易于培養(yǎng)；但連續(xù)性細胞系由于連續(xù)傳代，細胞的形態(tài)、結構、功能發(fā)生了一定的變化，傳代代數(shù)越多，發(fā)生的變化也越大，因而對實驗結果有一定的影響。原代培養(yǎng)細胞技術相對要復雜得多，而且培養(yǎng)成功率較低，費時費力，因此不為許多研究者選用；但原代細胞剛離體，在形狀、結構、功能等方面與體內細胞更接近，相對能更好地代表其來源組織的細胞類型及組織特異性，更好地保留膠質瘤的生物學特性，更接近也更能反映體內生長特性，所以原代培養(yǎng)出的細胞更適合做藥物敏感實驗、放射敏感實驗等基礎實驗研究。

原代單層細胞培養(yǎng)常用的方法有：組織塊原代培養(yǎng)以及單細胞懸液法培養(yǎng)。前者是將膠質瘤組織塊貼附在培養(yǎng)瓶（板）上，一般1~2天就會有細胞從組織塊邊緣游出，利用游出的細胞進行培養(yǎng)；后者是將組織塊通過機械分離或酶消化法或者二者結合的方法分離成單細胞懸液，再接種于培養(yǎng)瓶（板）進行培養(yǎng)的方法［6，7 ］。

傳代單層細胞培養(yǎng)的方法相對簡單一些，只需將需要傳代的細胞用胰蛋白酶消化吹打后，按需要接種于培養(yǎng)瓶內，補足培養(yǎng)液即可。

以上為傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法，在此基礎上又發(fā)展出一些培養(yǎng)方法，如：單細胞分離培養(yǎng)法、加支持物培養(yǎng)法、球體細胞培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法等。單細胞分離培養(yǎng)也就是克隆培養(yǎng)，國內孫立軍、黃強等［8］已經(jīng)通過對SHG-44細胞系單克隆化，建立了具有低、中、高3種不同分化程度的人膠質瘤細胞株。加支持物培養(yǎng)法是為了實驗研究或便于觀察而預先向培養(yǎng)瓶/板內加入支持物；如為了做細胞免疫組化，預先在培養(yǎng)板內放入小玻片，再培養(yǎng)細胞，待細胞長在玻片上，取出固定、染色，也稱為爬片。球體細胞培養(yǎng)是將長成片的細胞移入不易貼附的底物上，則細胞片能卷聚生長成球形。懸浮培養(yǎng)法，顧名思義就是讓原本貼壁生長的細胞懸浮生長。李茗初等［9］運用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)C6膠質瘤細胞系，從中分離出該細胞系的干細胞。

單層細胞培養(yǎng)是目前最常用的一種培養(yǎng)方式，已廣泛應用于各項基礎研究。

2.1.1 在放射治療研究中的應用 目前膠質瘤細胞系眾多，不同細胞系有各自不同的特點，如MO54對輻射敏感，而T98則對輻射抵抗［10］；U373、U251、U118MGT-98G表達突變型p53，而U87、D54、A172、CCF-STTG1細胞表達野生型p53。針對不同細胞系的特點，在實驗研究時可以根據(jù)需要而加以選擇。Ostruszka等［11］在研究細胞周期進程中由2，2-二氟脫氧胞嘧啶核苷(2′， 2′-difluoro-2′-deoxycytidine; dFdCyd)引起的放射敏感性的作用中運用了2種人膠質瘤細胞系U251和D54，并且發(fā)現(xiàn)U251對dFdCyd的細胞毒性更敏感，dFdCyd也是U251的放射增敏劑，這種差異在于U251表達突變型p53，而D54細胞表達野生型p53，在D54細胞聯(lián)合dFdCyd和電離輻射后，突出表現(xiàn)在G1期阻滯。Chen等［12］在研究DB-67作為一種新型DNA拓撲異構酶具有靶向輻射增敏劑的研究中也運用了表達野生型p53和突變型p53的D54-MG和T-98G膠質瘤細胞系。Shono等［13］采用將腺病毒載體-p53(Ad-p53)導入表達突變型p53的膠質瘤細胞系U251、U373和表達野生型p53的U87、D54細胞系，Ad-p53能通過增加表達野生型p53膠質瘤細胞的凋亡趨勢來提高它們的放射敏感性，并進一步揭示Ad-p53轉染的人膠質瘤細胞所誘導的凋亡和磷酸化區(qū)域特異性的位點相關。

2.1.2 在化療藥物研究中的應用 膠質瘤化療效果差，這主要與缺乏有效的化療藥、全身化療時化療藥難以通過血腦屏障以及腫瘤耐藥有關。因此膠質瘤細胞培養(yǎng)廣泛應用于新藥開發(fā)。

Das等［14］用U87-MG研究地塞米松能夠通過維持Bax:Bcl比率來保護人膠質瘤細胞U87-MG免于遭受替莫唑胺誘導的凋亡，提示膠質瘤患者接受替莫唑胺化療之前如果用地塞米松將會產(chǎn)生非預期效果，為指導臨床治療打下基礎。Landen等［15］在研究那可丁通過血腦屏障及抑制膠質瘤生長時利用鼠C6細胞系，證明那可丁可以抑制C6細胞增殖，并測定那可丁通過一層培養(yǎng)的腦微血管內皮細胞比率，并且與已知的滲透劑和非滲透劑相比較，來作為體外測定那可丁通過血腦屏障的方法。

2.1.3 在生物和基因治療研究中的應用 生物治療主要是通過調動宿主天然防衛(wèi)機制或給予機體某些物質來取得抗腫瘤效應。對抗腫瘤防御機制的基礎理論的深入了解以及生物反應調節(jié)劑（BRMs）的不斷發(fā)現(xiàn)和應用使得生物治療前景廣闊。BRMs大致有以下幾類：天然或基因重組細胞因子、抗腫瘤的各類體細胞和輔的造血干細胞、抗體、基因治療、腫瘤疫苗、抗血管生成藥、細胞分化誘導劑、某些菌類及其有效成分、植物藥包括中藥的有效成分、有機酸及小分子合成劑、其他類型。

隨著生物治療研究的不斷升溫，膠質瘤的細胞培養(yǎng)已廣泛應用于膠質瘤生物治療的許多方面，如：Friese等［16］利用人膠質瘤細胞系和鼠膠質瘤細胞系GL261 和SMA-560研究NKG2D，腫瘤細胞表達的配體激活免疫受體NKG2D 刺激由NK、γδT和CD8+T細胞介導的腫瘤免疫。人膠質瘤細胞表達NKG2D的配體MICA、MICB和一些UL16-結合蛋白家族，然而膠質瘤細胞因為高表達Ⅰ型MHC抗原而抵抗NK細胞的細胞毒作用，體外實驗中質粒介導或腺病毒介導在膠質瘤細胞過表達的MICA可提高它們對NK和T細胞的應答。

腫瘤疫苗也是當今研究熱點之一，制備以及測試抗膠質瘤疫苗都需要膠質瘤細胞培養(yǎng)。如利用膠質瘤細胞致敏樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）制備膠質瘤疫苗。Driessens等［17］發(fā)現(xiàn)被γ射線或化療藥（順鉑和絲裂霉素）作用后凋亡的膠質瘤9L細胞聯(lián)合鼠來源的成熟DCs分泌GM-CSF顯示較好的治療腫瘤潛能。Giezeman-Smits等［18］發(fā)現(xiàn)用白介素-4(IL-4)轉染膠質瘤9L細胞制備的腫瘤疫苗能夠誘導親代腫瘤發(fā)生特異的、有保護性的免疫應答。

針對膠質瘤基因治療的研究也越來越多，如單純皰疹病毒胸腺激酶(HSV-TK)基因/丙氧鳥苷(GCV)系統(tǒng)、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(Ec-CD)基因/5 氟胞嘧啶(5-FC)系統(tǒng)；早期生長反應基因-1啟動子（pEgr-1）；CEA-啟動子等［19~ 22］。

2.1.4 在動物模型研究中的應用 培養(yǎng)的膠質瘤細胞還可以用于建立動物模型，為研究膠質瘤發(fā)病機理以及治療提供良好的實驗對象。如利用鼠類細胞系立體定向注射于大鼠顱內建立鼠膠質瘤模型等。Prins等［23］通過向C57BL/6 (H-2b)雌鼠的腹側皮下注射GL26膠質瘤細胞以及將GL26膠質瘤細胞立體定向注射于大鼠顱內建立鼠膠質瘤模型，用于研究黑色素瘤相關抗原（MMAs）的靶向免疫治療。

2.1.5 在其他方面研究中的應用 膠質瘤細胞培養(yǎng)除用于上述研究外，還廣泛應用于其他研究方面，如探討膠質瘤細胞與正常星型細胞之間的作用機制；膠質瘤細胞凋亡機制以及侵襲轉移機制等。Zhang等［6］在研究惡性膠質瘤細胞和星型細胞之間的直接縫隙連接的交流中采用了原代培養(yǎng)的膠質瘤細胞和原代培養(yǎng)的星型細胞。Joy等［3］利用SF767 和T98G膠質瘤細胞系研究發(fā)現(xiàn)惡性膠質瘤細胞激活P13-K途徑并且表現(xiàn)降低凋亡的敏感性。Yamamoto等［24］利用SNB-19、D-54MGU、87 MG、U-373 MG、U-118 MG和SW1088研究N-glycan在調節(jié)膠質瘤遷移和侵襲中的作用。

2.2 三維（立體）培養(yǎng)及應用 單層細胞培養(yǎng)雖然已經(jīng)得以廣泛應用，但也有其不足之處：第一，具有遺傳不穩(wěn)定性；第二，是一個平面結構，而人體是三維立體結構，與人體環(huán)境相差很遠。針對這些不足，許多科研工作者也嘗試用立體培養(yǎng)，因為環(huán)境對細胞的生長分化有著至關重要的作用。已有科研證明異位植入的胚胎細胞能轉化為惡性細胞，并引發(fā)癌癥，而相同的細胞在子宮內則可形成正常的胚胎；相反畸胎瘤細胞植入胚胎內可能經(jīng)歷正常的發(fā)育過程。

與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式相比，三維立體培養(yǎng)的細胞在細胞形狀和細胞環(huán)境更接近于活體內狀態(tài)，而形狀和環(huán)境能決定細胞的基因表達和生物學行為。三維細胞培養(yǎng)優(yōu)點還在于具有清晰的幾何學形狀，這使其結構與功能直接相關，從而可以進行理論分析［25］。Joki等［26］在研究環(huán)氧化酶-2的實驗中運用了三維培養(yǎng)系統(tǒng)，證明環(huán)氧化酶-2抑制劑NS-398對膠質瘤細胞生長和遷移有抑制作用。

但是三維立體培養(yǎng)也不能完全模擬體內環(huán)境，而且立體培養(yǎng)的模型在目前條件下難以無限生長下去，主要是因為模型長到一定大小時，由于模型中心缺乏營養(yǎng)或缺氧而壞死。因此如何解決這些問題，還需要進一步努力。

2.3 其他培養(yǎng)方法及應用 目前培養(yǎng)和應用膠質瘤細胞除了單獨應用上述培養(yǎng)方法以外，還有共培養(yǎng)（coculture）方法，即將2種或2種以上的細胞一起培養(yǎng)的方法，其實質也是單層細胞培養(yǎng)；也有嘗試2種或幾種方法聯(lián)合應用，如同時選用單層細胞培養(yǎng)及三維立體培養(yǎng)。

Zhang等［6］將原代培養(yǎng)的人膠質瘤細胞和原代培養(yǎng)的鼠星型細胞共培養(yǎng)，并認為2種細胞之間的縫隙連接的形成不是自然的，因為將膠質瘤細胞注射入活鼠腦內很快就能和宿主細胞功能性耦聯(lián)在一起，而且和膠質瘤細胞耦聯(lián)在一起的縫隙連接似乎可以調節(jié)星型細胞的表型。和膠質瘤細胞共培養(yǎng)的星型細胞表達Cx43顯著降低并可以低水平表達GFAP。

Joki等［26］在研究環(huán)氧化酶-2的實驗中除了運用三維培養(yǎng)系統(tǒng)外，還運用了單層細胞培養(yǎng)檢測NS-398抑制膠質瘤細胞增殖以及運用共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測腫瘤細胞侵襲入正常鼠腦細胞。

3 展 望

提到膠質瘤細胞培養(yǎng)就不得不關注膠質瘤干細胞的研究。目前除膠質瘤細胞原代培養(yǎng)以及膠質瘤細胞系的培養(yǎng)外，還有人通過原代無血清培養(yǎng)、神經(jīng)干細胞培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)以及CD133免疫磁珠分離等方法成功地分離、培養(yǎng)出膠質瘤干細胞。膠質瘤干細胞的分離、培養(yǎng)及研究是目前膠質瘤研究的熱點，該研究將為膠質瘤的診斷與治療帶來新的突破與希望。

膠質瘤血管發(fā)生、形成、血管結構改變以及與周圍組織的關系也是當今研究熱點，而這方面研究也需要細胞培養(yǎng)技術。通過該研究有利于闡明膠質瘤的浸潤、轉移與其血管生成、結構之間的相關性，以及化療藥物透過血腦屏障的藥代機制等。所以膠質瘤的細胞培養(yǎng)是一項非常重要的基礎技術，相信新的培養(yǎng)技術會不斷產(chǎn)生，新的應用領域會不斷發(fā)現(xiàn)。

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第5篇：干細胞培養(yǎng)技術范文

【關鍵詞】 川芎； 胚胎干細胞； 細胞分化； 心肌細胞

【Abstract】 Objective：To explore the features of differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes induced by Chuanxiong containing serum，establish a simple and efficient system of ES cells differentiation cardiomyocyte.Method：The action of ES cell activity under Chuanxiong containing serum were observed，visible spontaneous and rhythmic beating embryoid bodies occurred at 3 d，reached peak at 5 d.Myocardial cell specific genes β-MHC were detected by using RT-PCR method.Result：Compared with the rat serum and fetal bovine serum group，theβ-MHC of the cells cultured by Chuanxiong containing serum expression and differentiation rate increased significantly，the differences were statistically significant（P

【Key words】 Chuanxiong； Embryonic stem cells； Cell differentiation； Cardiomyocyte

First-author’s address：Longgang Central Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518116，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.30.005

心肌細胞移植在臨床中已經(jīng)廣泛使用，移植細胞包括多種，其中最適合于移植的細胞為胚胎干細胞，主要是由于其具有較強的分化能力和增殖能力。胚胎干細胞分化為心肌細胞是研究心肌細胞分化機制的良好平臺和模型[1-2]。隨著現(xiàn)代藥學的發(fā)展，人們更加重視中藥的應用，中藥歷史悠久，很多中藥均具有較好的活性，可用于疾病的治療，其中保護心肌功能的中藥應用也較為廣泛，具有保護心肌、改善機體免疫功能、促進蛋白增長及防治細胞凋亡等特點[3-4]。與傳統(tǒng)的化學藥品相比，中藥具有安全有效、價格便宜等特點[5-6]。本實驗利用胚胎干細胞實驗模型，對川芎含藥血清誘導小鼠胚胎干細胞分化為心肌細胞進行實驗研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 中藥川芎含藥血清的制備 選取健康未過的SD雄鼠30只[許可證編號：syxk（粵）2013-0085，廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心]，個體質量（200±10）g，適應性飼養(yǎng)3 d后進行實驗。將其隨機分為空白對照組、低劑量組及高劑量組，每組10只。給予大白鼠川芎水煎液灌胃（取一定量川芎飲片置容器中，加水沒過藥面，浸泡30 min后，煎煮3次，60 min/次，合并水煎液，過濾，濃縮至含生藥1 g/mL備用），低劑量組的劑量約為正常用量（0.8 g/kg）的5倍，為4 g/kg，2次/d，連續(xù)3 d；而高劑量組則為正常用量的30倍，為24 g/kg，

2 次/d，連續(xù)3 d，空白對照組灌生理鹽水（4 mL/kg）。人與大鼠動物等效劑量系數(shù)由《實驗動物學》可知為6.3。每次給藥10 min后，對其進行取血，將血液靜置2 h后離心（離心條件：3000 r/min，離心10 min），離心后取上清液56 ℃加熱30 min，過濾，保存于-20 ℃。體外含藥血清按20%計算[7-10]。

1.2 胚胎干細胞培養(yǎng)

1.2.1 來源與試劑 小鼠胚胎干細胞選自中科院生化細胞研究所[11-12]；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、明膠、β-巰基乙醇（β-ME）、絲裂霉素C、非必需氨基酸（NEAA）購自美國GIBCO公司，白血病抑制因子（LIF）購自法國Millipore公司。

1.2.2 胚胎干細胞培養(yǎng)與誘導分化 將凍存在液氮罐中的胚胎干細胞取出，于37 ℃水浴鍋中迅速融化，將細胞立即轉移至10 mL的ep管中，加入適量的培養(yǎng)基，采用300 rcf，10 min離心，去除上清液，加入1 mL培養(yǎng)基吹打，轉移細胞并進行培養(yǎng)，當細胞生長至70%左右時，對細胞進行傳代。培養(yǎng)液分四組，即：川芎血清低劑量組、川芎血清高劑量組、大鼠血清組、胎牛血清組，將收集到的川芎含藥血清和大鼠血清、胎牛血清，配制成10 mL備用，各組培養(yǎng)液終濃度為20%。（1）懸滴培養(yǎng)：ES細胞中加入20%川芎含藥血清（低劑量組和高劑量組）的分化培養(yǎng)液，將細胞密度設置為3.75×104/mL。細胞培養(yǎng)在6 cm培養(yǎng)皿中，取1.6 mL細胞置于10 cm的培養(yǎng)皿內蓋上，將內蓋翻轉使其生長，加入5 mL PBS，孵育1 h。（2）懸浮培養(yǎng)：細胞孵育后對細胞進行觀察，控制細胞懸滴液中細胞個數(shù)為1，第2天于倒置顯微鏡下觀察，每個懸滴內均含有1個，吸去PBS，加入分化培養(yǎng)基，移至6 cm中培養(yǎng)，孵育2 h。（3）貼壁培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)2 d后，觀察細胞個數(shù)，大約為10個，接種至4孔板，第3天時肉眼觀察每個培養(yǎng)皿中均可見數(shù)十個EBs。分別接種至事先用明膠包被的24孔板內，每孔中加入2 mL分化培養(yǎng)液。

1.3 實時定量PCR檢測心肌細胞特異基因β-MHC的表達 實驗細胞分四組，即川芎血清低劑量組，川芎血清高劑量組，大鼠血清組和胎牛血清組，每組6孔。提取總RNA并測定濃度，分析其完整性，進而合成cDNA，β-MHC Forward：5’-AGAGCTCATCCTTTCTGGTCAT-3’，Reverse：5’-ACCATCTGACATTCTACAGTCT-3’；GAPDH Forward：5’-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’Reverse：5’-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’[4-5]。PCR體系為：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR MasterMix，2.5 μL樣品溶液，1.0 μL引物加水至25 μL。反應條件：95 ℃下加熱60 s，進行預變性；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，如此循環(huán)40次。擴增后的產(chǎn)物主要是采用熒光檢測，用ABI 7500 Software v2.0軟件對其進行分析，繪制曲線表，計算Ct值，對系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理后可以得出不同濃度對于細胞分化的影響。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，以P

2 結果

2.1 川芎誘導小鼠胚胎干細胞向心肌細胞的分化 細胞培養(yǎng)2 d后呈密集狀態(tài)，一般為圓形，細胞界限和形態(tài)不明顯（圖1）；體外細胞個頭小，但生長速度快（圖1～2）。川芎分化液培養(yǎng)3 d的胚胎干細胞會收縮配體，導致培養(yǎng)時間增加，收縮越明顯，則時間越長。自發(fā)節(jié)律性收縮區(qū)域較大，且細胞形態(tài)較單一（圖3～4）。于細胞培養(yǎng)的第3 d可見零星EB球發(fā)生自發(fā)性節(jié)律性跳動，5 d時約有70%的EB球出現(xiàn)節(jié)律性跳動，低、高劑量川芎血清組（圖3～4）EB球發(fā)生自發(fā)性節(jié)律性跳動的細胞數(shù)量明顯多于胎牛血清（圖1）和大鼠血清組（圖2）。

2.2 實時定量PCR檢測心肌細胞特異基因β-MHC的表達 川芎低、高劑量含藥血清組β-MHC表達量均明顯高于胎牛血清組和大鼠血清組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P

3 討論

隨著人們生活水平的進步，大部分人均處于亞健康狀態(tài)，心血管疾病是臨床上常見的疾病。心血管疾病的臨床突破主要來自胚胎干細胞的發(fā)展，胚胎干細胞會根據(jù)誘導自發(fā)分化成多種細胞，如心肌細胞和血管內皮細胞等[13-15]。心肌細胞對于恢復正常供血、免疫功能均有重要的意義[16-17]。一般情況下，胚胎干細胞能夠自然分化，但分化率低，因此提高分化率顯得至關重要。臨床上對于胚胎干細胞的研究較為廣泛，但是研究方向各不相同，關于中藥的研究更是鳳毛麟角，因為涉及人體、細胞、動物等各個方面，給研究工作帶來了一定的困難，但也有部分學者取得了可喜的成果[18-19]。有研究方向為將細胞采用不同密度制成懸浮液，采用不同的方法和改變環(huán)境進行培養(yǎng)，分析其分化成心肌細胞的分化率。最后對具有促進分化功能的中藥進行相關的安全性評價，致力應用于臨床。川芎是傘形科藁本屬植物，經(jīng)研究表明，其具有多種臨床功效，如使血管擴張、增加腦部血流量、改善供血、降低血液黏稠度及改善心肌缺血[20]。本課題組在研究川芎含藥血清的胚胎毒性時發(fā)現(xiàn)川芎含藥血清對胚胎干細胞轉化為心肌細胞有促進作用（P

參考文獻

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第6篇：干細胞培養(yǎng)技術范文

[關鍵詞]辛伐他??；牙髓干細胞；增殖；分化

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）02-0263-04

辛伐他汀是脂類代謝途徑中的限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglut aryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）還原酶的抑制劑，臨床常用于降低膽固醇、降低血脂，減少心臟病的發(fā)生[1]。1999年Mundy在Science發(fā)表文章，報道辛伐他汀在骨代謝方面的影響，其實驗研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可顯著增加成骨細胞數(shù)量，減少破骨細胞數(shù)量，促進松質骨骨量增加，證明辛伐他汀具有良好的促進骨修復的性能[2]。此后，國內外學者也通過多項實驗證實了辛伐他汀的促成骨分化特性。但以往的研究表明，不同的他汀類藥物對不同類型的細胞，其增殖效應是不同的。他汀類藥物可能抑制平滑肌細胞和內皮細胞的增殖，但卻可以提高成纖維細胞的有絲分裂活性。故本實驗采用噻唑藍法、堿性磷酸酶活性檢測、茜素紅染色等多種方法，研究辛伐他汀對人牙髓干細胞增值及分化的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料：胎牛血清（Hyclone，美國）；DMEM F/12（Gibco，美國）培養(yǎng)基；3mg/ml Ⅰ型膠原酶（Gibco，美國）；0.25% 胰酶（碧云天生物技術研究所，上海）；青鏈霉素（碧云天生物技術研究所，上海）；PBS緩沖溶液；100μmol/L 抗壞血酸（sigma，美國）；10mmol/L β-甘油磷酸鈉（sigma，美國）；2mmol/L L-谷氨酰胺（sigma，美國）；茜素紅（Sigma，美國）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）；噻唑藍（Amresco，美國）；辛伐他?。╯igma，美國）；二甲基亞砜（sigma，美國）；Triton X-100（碧云天生物技術研究所，上海）。

1.2 人牙髓干細胞分離培養(yǎng)及傳代：選擇哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二臨床醫(yī)院口腔外科門診采集的因正畸拔除的正常前磨牙或阻生的正常第三磨牙（患者14～25歲），所有成年患者及未成年患者家屬均知情同意。依據(jù)Gronthos DPSCs 原代細胞培養(yǎng)法[3]，劈開實驗牙，用鑷子取出牙髓，含雙抗PBS充分沖洗，置于體積分數(shù)為0.3%的Ⅰ型膠原酶和0.4%的分散酶（1：1）37℃橫濕振蕩器內消化1h，200目尼龍篩過濾懸液至10ml離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，加入含20%FBS培養(yǎng)基，吹打混勻，血球計數(shù)板計數(shù)以1×108個/L細胞接種至50ml培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液兩次，細胞融合達80%后，0.25%胰蛋白酶消化，1∶2比例傳代。

1.3 DPSCs鑒定：克隆團分選技術將DPSCs懸液進行純化分離，流式細胞技術鑒定DPSCs，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，細胞常規(guī)傳代至第3代用于后續(xù)實驗[4-5]。

1.4 MTT染色實驗：將DPSCs以5×103個/孔接種在九十六孔板中，在37℃、體積分數(shù)為5%C02飽和濕度條件下，于礦化培養(yǎng)液中（DMEM F/12培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、100μmol/L抗壞血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，2mmol/L L-谷氨酰胺[6-7]），分A、B、C、D、E五組，加入不同濃度辛伐他汀，進行細胞培養(yǎng)。各組辛伐他汀濃度為A組：1×10-5mol/L；B組：1×10-6mol/L； C組：1×10-7mol/L； D組：1×10-8mol/L；E組：0 mol/L。于細胞培養(yǎng)第3天加入MTT 20μl，37℃孵育4h，吸去孔內培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜150μl，培養(yǎng)板均勻振蕩10min，自動酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（A）值，觀察各組細胞增值情況。

1.5 ALP活性測定：細胞培養(yǎng)條件同MTT實驗，細胞培養(yǎng)分為ABCD四組，各組辛伐他汀濃度為：A組：1×10-6mol/L；B組：1×10-7mol/L； C組：1×10-8mol/L； D組：0 mol/L。培養(yǎng)3天時，去除培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，0.01mol/L PBS沖洗細胞3次，加入50μl 0.1% Triton X-100，4℃冰箱過夜，光鏡下觀察已無明顯細胞結構，反復吹打后每個樣本加入ALP緩沖液和基質液各50μl，充分混勻，37℃水浴15min，加入顯色劑150μl，在酶標儀上選擇520nm波長檢測各孔A值。觀察各組細胞ALP活性，找出辛伐他汀誘導DPSCs成骨分化的最佳濃度。

1.6 茜素紅鈣結節(jié)染色：將DPSCs以1×105個/孔接種于六孔板中，細胞分組及培養(yǎng)條件同ALP檢測實驗。DPSCs于14天進行茜素紅染色，培養(yǎng)皿PBS緩沖液沖洗3遍，95%無水乙醇固定15min，蒸餾水沖洗3次，0.1%茜素紅-Tris-HCl（pH=8.3）37℃，30min，蒸餾水輕輕沖洗，干燥。

1.7 統(tǒng)計學分析：使用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件，計量資料采用“均值±標準差”形式描述。

對實驗組與對照組檢測結果進行t檢驗和方差分析。

2 實驗結果

2.1 DPSCs光學顯微鏡下細胞形態(tài)學變化：DPSCs原代培養(yǎng)24h內細胞貼壁緩慢，可見細胞為梭形，形態(tài)較小，未完全伸展，且有少量懸浮未貼壁細胞。48h，細胞梭形，貼壁較多，少量細胞呈克隆團狀生長，見圖1。7天后可見DPSCs大量擴增，呈伸展長梭形，克隆團狀聚集生長，細胞融合率可達80%。

2.2 辛伐他汀對DPSCs增殖能力的影響：與對照組E組比較，A、B、C、D四組辛伐他汀對細胞增值均有一定的抑制作用，其中A組、B組、C組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P

2.3 辛伐他汀對DPSCs堿性磷酸酶活性的影響：A、B、C組測得的A值明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P

2.4 辛伐他汀對DPSCs礦化的影響：DPSCs 14天培養(yǎng)后，可見部分細胞發(fā)生成骨細胞樣多角形以及錐體形態(tài)改變。DPSCs在礦化誘導后逐漸產(chǎn)生白色點狀晶體。經(jīng)茜素紅染色后光學顯微鏡下均可見橘紅色礦化結節(jié)，呈團狀不規(guī)則形態(tài)。如圖3。

3 討論

實驗研究表明，DPSCs可向神經(jīng)細胞、脂肪細胞、肌細胞、成骨細胞等多種細胞分化[8-13]，擁有多向分化的潛能，它可以作為一種組織工程的種子細胞，用于頜骨缺損的修復治療。目前，各種藥物、細胞因子及可溶性蛋白的添加廣泛用于誘導DPSCs的骨向分化，如抗壞血酸、血管內皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子等[11-13]。辛伐他汀作為一種新發(fā)現(xiàn)藥物，已被證實具有促進成骨的活性。Wang PS等人的多項統(tǒng)計分析表明，辛伐他汀可以明顯提高絕經(jīng)后婦女和老年人的骨密度， 降低骨折發(fā)生的比例[14-16]。Maeda 等研究辛伐他汀對非轉化成骨樣細胞（MC3T3-E1）和鼠骨髓細胞的影響，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能提高成骨細胞ALP活性和促進礦化結節(jié)形成[17]。

在骨形成過程中，成骨細胞的演化經(jīng)歷細胞增殖、細胞外基質成熟、礦化和細胞凋亡4個不同階段，各階段調控精細，不同標志物特異性表達。ALP的表達是成骨細胞分化的主要特征之一，是基質成熟的早期標志物，其作用是水解有機磷酸釋放出無機磷，促使基質礦化[18-19]。ALP是骨形成所必需的酶，它的表達表明細胞分化和骨組織形成的開始，代表著骨形成的狀況。礦化能力是干細胞成骨的重要特性之一，組織內的鈣質大部分以磷酸鈣或碳酸鈣的形式存在，茜素紅AR-S法通過鈣離子與茜素紅特異性結合，可使礦化結節(jié)呈現(xiàn)鮮紅色，因此茜素紅染色是鑒定成骨分化的較特異的方法。

本實驗采用MTT法、ALP試劑盒、茜素紅染色法檢測辛伐他汀對人牙髓干細胞的影響。結果顯示，辛伐他汀抑制牙髓干細胞的增值，但對牙髓干細胞向成骨細胞分化具有促進作用。預示該藥具有骨缺損治療的臨床應用前景，為頜骨骨缺損的組織工程修復提供了理論依據(jù)。辛伐他汀對人牙髓干細胞影響的研究還不成熟，本實驗只是進行了初步的探討，具體的藥物濃度、作用方式和作用機制還有待進一步研究。

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第7篇：干細胞培養(yǎng)技術范文

[關鍵詞] 神經(jīng)干細胞；慢病毒載體；轉基因；神經(jīng)營養(yǎng)素-3；腦缺血

應用干細胞移植技術來治療中風等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎研究已取得一定進展。但到目前為止，還沒有直接證據(jù)表明移植細胞能和宿主的神經(jīng)網(wǎng)絡建立有功能的突觸聯(lián)系[1]。近年來，研究方向已轉向促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system， CNS）內源性NSCs的增殖、存活及向神經(jīng)元方向分化[1]。本研究旨在進一步探討細胞移植后對大鼠海馬區(qū)內源性細胞增殖及向神經(jīng)元方向的分化的影響。

1材料和方法

1.1 實驗動物及器械

孕14天Sprague-Dawley大鼠1只及雄性Sprague-Dawley大鼠（體重230g～250g）由汕頭大學醫(yī)院實驗動物中心提供。15ml離心管（Corning，Mexico）， 低溫離心機（Lock-Song，北京路科順高新技術有限公司），一次性200目尼龍細胞篩（BD Falcon，美國），24孔培養(yǎng)板（Corning，美國）， 25cm2細胞培養(yǎng)瓶（Corning，美國），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo forma 3110 series， 美國），倒置熒光顯微鏡（Leica，德國），手術顯微鏡（Leica，德國），立體定向儀（江灣II型-C）。

1.2 實驗試劑

干細胞培養(yǎng)液：DMEM/F12培養(yǎng)液（Gibco，美國），添加b-FGF（20ng/ml，Cytolab/Peprotech Asia，美國）、EGF 20ng/ml，Cytolab/Peprotech Asia，美國），1%濃度的N2和2%濃度的B27添加劑（Invitrogen，美國），谷氨酰胺（2mmol/ml，Hyclone， 美國）、青霉素（10u/ml， Gibco ，美國）、鏈霉素（10mg/ml， Gibco ，美國）。4℃保存。0.25%胰蛋白酶（Gibco ，美國），胎牛血清（Invitrogen，美國）； 10%水合氯醛（Sigma-Aldrich） ； 表達hNT3基因的慢病毒載體（LV/ hNT-3，上海吉凱基因化學技術有限公司構建）。

1.3 神經(jīng)干細胞分離、培養(yǎng)及hNT-3基因修飾

從孕14天Sprague-Dawley胎鼠海馬組織提取NSCs，進行體外無血清培養(yǎng)、擴增和純化 [2]。經(jīng)免疫熒光Nestin染色鑒定后，取第五代的神經(jīng)干細胞球，用0.125%的胰蛋白酶消化和機械吹打的方法，使神經(jīng)球分散成3～5個細胞一簇；4℃離心1000rpm×5min，吸走上清，再用干細胞培養(yǎng)液洗滌細胞兩次；用干細胞培養(yǎng)液重懸細胞，以1×105 cells /500µl/孔接種于24孔板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3～4h后，各孔以最佳感染復數(shù) （multiplicity of infection， MOI）為10的比例加入LV/ hNT-3稀釋液100µl， 10h后置換出病毒液，培養(yǎng)條件不變。已轉染hNT-3基因的NSCs命名為NSCs-hNT3。

1.4 大鼠缺血再灌注模型（tMCAO）建立及細胞移植

參考Pringle等的方法，建立大鼠tMCAO模型[3]，右側大腦中動脈阻斷時間為2h。tMCAO模型建立后7d，選取神經(jīng)損害程度評分[4] （Neurological Severity Scores，NSS）為8～9分的大鼠，隨機分為NSCs-hNT3治療組、NSCs治療組及生理鹽水對照組，各組動物數(shù)均為6個（最終納入實驗數(shù)）。細胞治療組分別移植NSCs-hNT3或NSCs 2 00，000 cells/10µl，生理鹽水對照組注射10µl生理鹽水。具體方法參照文獻報道[2]。

1.7 BrdU標記及標本取材

三組大鼠，在細胞移植7天后開始腹腔注射BrdU（50 mg/kg， b.i.d，共6天），對內源性新增殖的細胞進行標記。在最后一次注射結束后24h內（細胞移植后第14天），完成NSS評分后，處死動物取材。具體是：以10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用冰生理鹽水和4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌洗固定后，取出腦標本，4%多聚甲醛4℃下后固定24h，30％蔗糖脫水48h。標本用冰凍切片機行冠狀位連續(xù)冰凍切片，片厚20 µm。切片取材部位為背側海馬區(qū)（冠狀縫后3.0 mm-4.5 mm）。切片收集到24孔板內，浸泡在凍存液內-20℃保存?zhèn)溆?。每?張取1張切片用于免疫熒光組織化學染色，對體內新增殖的細胞及其分化進行檢測。

1.8 免疫熒光雙標染色

取24孔板，孔內預先加入TBS。將冰凍切片從凍存液內取出放入板孔內，行抗BrdU/DCX雙標染色。具體如下：（a） TBS洗3次，每次5min；（b） 50%甲酰胺/2×SSC在65℃條件下作用2h；（c） 吸去液體后用2×SSC洗2次，每次5min；（d） 2N的HCl 37℃處理10 min；（e） 0.1M的硼酸緩沖液室溫下10min，TBS洗3次，每次5min；（f） 3%H2O2 37℃處理10 min ，蒸餾水洗3min，TBS洗5min；（g） 用含5%羊血清、0.1%BSA、0.1%TritonX-100的TBS在37°C封閉30min；（h） 吸去封閉液，加入小鼠抗BrdU IgG （1：100）與兔抗DCX IgG （1：100），將腦片漂浮在上述抗體中，4°C孵育過夜；（i） TBS洗3次后， 各孔內加入用封閉液稀釋的FITC標記的羊抗鼠和TRITC標記的羊抗兔的二抗混合液（1：100）。室溫暗盒中作用40min后，各孔再加入0.1%的DAPI進行細胞核染色，繼續(xù)作用10min；（j）TBS洗3次后用毛筆把腦片裱貼在載玻片上，并用 50%甘油封片，置熒光顯微鏡下觀察，參考Baldauf [5]方法對海馬齒狀回SGZ和SCZ區(qū)域800µm范圍進行細胞計數(shù)、照相。用 Image plus 6.0圖像處理軟件來處理和分析圖像。

1.9 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以X±S表示，組間細胞計數(shù)先應用Kruskal-Walis法進行差異性檢驗，再用Mann-Whitney’ U檢驗進行兩兩比較。應用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。

2結果

2.1 神經(jīng)干細胞培養(yǎng)及鑒定

原代培養(yǎng)5～7天， 即形成懸浮生長的神經(jīng)球（圖1），免疫熒光Nestin染色陽性，在熒光顯微鏡下觀察呈綠色（圖2）。

圖1倒置顯微鏡下觀察呈懸浮生長的神經(jīng)干細胞球

圖2熒光顯微鏡下觀察呈綠色的

Nestin 染色陽性的神經(jīng)干細胞球

2.2 免疫熒光染色

圖3免疫熒光染色

各組大鼠缺血側海馬DG區(qū)新增殖的BrdU+細胞（紅色）、DCX+細胞（綠色）及非特異性細胞核DAPI染色（藍色）。其中 A-E 為NSCs-hNT3治療組，A1-E1為 NSCs治療組；A2-E2為生理鹽水對照組。D、D1及D2分別為對應組別的融合圖像，BrdU+/DCX+的細胞顯示為黃色。E、E1及E2分別為對應組別融合圖像的局部放大，箭頭所示為BrdU+/DCX+細胞，即海馬DG區(qū)新增殖并已向神經(jīng)元方向分化的內源性細胞。Bars=100µm

圖4各組缺血側海馬DG區(qū)增殖細胞數(shù)比較。

*表示組間比較，統(tǒng)計學差異顯著（P

雖然海馬組織未直接受到缺血性損傷，但是缺血發(fā)生后，缺血性損傷同側海馬區(qū)也會出現(xiàn)新生細胞增多，表現(xiàn)為BrdU+（紅色），主要位于齒狀回附近（圖3）。細胞移植2周后，Kruskal-Walis檢驗示3組間BrdU+細胞數(shù)有顯著性差異 （X2=13.36， P=0.001），NSCs-hNT3治療組和NSCs治療組海馬齒狀回SGZ和SCZ BrdU+細胞數(shù)（63.8±8.1 cells/800µm，52.5±6.7 cells/800µm）顯著高于生理鹽水對照組（13.3±2.5 cells/800µm）（P=0.004， P=0.004 respectively），且NSCs-hNT3治療組BrdU+性細胞數(shù)也顯著高于和NSCs治療組 （P=0.037）。DCX是未成熟神經(jīng)元的免疫學指標（綠色）。DAPI將細胞核非特異性染成藍色。用Image plus 6.0圖像處理軟件將三種不同染色圖像進行融合，顯示>90%的新增殖細胞為BrdU+/DCX+細胞（黃色）。三組之間BrdU+/DCX+細胞數(shù)也存在統(tǒng)計學差異（ X2=13.93， P=0.001），組間兩兩比較結果與BrdU+細胞數(shù)比較結果相一致（圖4）。

3討論

Parkinson，s病、中風及脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病是由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞結構和功能缺失所致，干細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究已取得一定進展。但遺憾的是，由于諸多因素的影響，移植的干細胞及其在宿主CNS內的子代細胞，大多數(shù)會在短期內死亡[1，7，8]，而且干細胞在體內自行分化成神經(jīng)元的比例低，是影響療效提高的重要因素。且到時目前為止，并沒有獲得移植細胞與宿主神經(jīng)網(wǎng)絡建立突觸聯(lián)系的確切證據(jù)。近來，基于干細胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究熱點，已轉向促進CNS內源性NSCs增殖并向神經(jīng)元方向分化，防止其凋亡，并整合到神經(jīng)網(wǎng)絡中，進而促進神經(jīng)系統(tǒng)功能和神經(jīng)網(wǎng)絡重塑[9]。

利用干細胞攜帶目的基因到達損傷部位或病灶局部，以達到修復損傷、治療疾病的目的， 是目前干細胞研究的另一個熱點 [10，11，12]。以NSCs作為基因治療的細胞載體，來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有其特別的優(yōu)點。NSCs不僅具有自我更新和多方向分化潛能，而且具有低免疫原性，以及向病灶和損傷部位敏銳的趨化性，移植基因修飾的NSCs， 一方面不僅可以突破血腦屏障的限制，在病變或損傷部位通過表達目的基因來發(fā)揮治療作用。另一方面有望解決基因治療的靶向性問題。而且與直接體內法（in vivo）比較，可以降低基因治療過程中病毒載體產(chǎn)生的免疫毒性反應。其次，NSCs移植到體內后，存活的時間比骨髓間充質干細胞、臍血干細胞等長，滿足基因長期表達的需要。此外，與其它載體細胞如成纖維母細胞不同，NSCs移植能分化成神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞[13] 。移植基因修飾的NSCs治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有望獲得細胞移植和基因治療的雙重療效。

在海馬DG區(qū)， 內源性NSCs增殖主要發(fā)生在腦缺血后第一周，到第2、3周則已恢復至至正常對照水平。新增殖的細胞存活可達3周 [7，8]。本研究中，我們在大鼠缺血再灌注腦損傷發(fā)生1周后，將NSCs-hNT3移植到大鼠紋狀體半暗帶，對照組移植普通NSCs或生理鹽水。我們發(fā)現(xiàn)，在細胞移植2周后（腦缺血3周后），生理鹽水對照組缺血側海馬區(qū)僅少許BrdU+細胞，與相關文獻報道一致。而與之比較，NSCs治療組缺血側海馬SGZ區(qū)BrdU+/DCX+細胞顯著增加（P=0.004），提示大鼠體CNS內源性NSCs增殖因外源性NSCs移植而增強，這可能是因細胞移植后，分泌了一些可改善缺血局部的微環(huán)境的營養(yǎng)因子，對CNS內源性神經(jīng)干細胞的增殖與存活發(fā)揮了促進作用。hNT-3是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，具有介導NSCs存活的作用[14]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷后修復過程中還能誘導干細胞向神經(jīng)元方向分化[15]。正常生理情況下，hNT-3的表達維持在較低水平。但經(jīng)基因hNT-3修飾的NSCs移植到大鼠CNS內，能夠表達豐富的hNT3因子[2]。這可能是NSCs-hNT3移植后，缺性性腦損傷大鼠海馬區(qū)內源性細胞增殖進一步顯著增強（P=0.037）的原因之一。在海馬DG區(qū)，免疫熒光染色示>90% 的新增殖細胞為BrdU與DCX染色雙陽性（BrdU+/DCX+），提示新生的NSCs主要向神經(jīng)元方向分化，也許其中部分細胞已經(jīng)分化成成熟的神經(jīng)元，不過有待進一步研究。

干細胞移植治療CNS疾病，其作用機理復雜，一般認為是通過分泌多種細胞因子及免疫調節(jié)物質起作用――即所謂的“旁路作用機理（bystander mechanism）”[1]。利用基因技術手段，對干細胞進行基因修飾已是相對成熟的技術。但基因修飾的干細胞在表達生成特殊細胞因子的同時，可能會使其它細胞因子的表達發(fā)生意想不到的變化。移植到宿主體內后，各種細胞因子的表達、調控及對CNS的影響更為復雜。對此，我們必須有清醒的認識。

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[13] Gage FH. Mammalian neural stem cells. Science [J]. 2000， 287：1433-1438.

第8篇：干細胞培養(yǎng)技術范文

【關鍵詞】骨髓間充質干細胞；細胞培養(yǎng)；細胞鑒定

【中圖分類號】R392.4【文獻標識碼】A【文章編號】1044-5511（2011）11-0346-02

骨髓間充質干細胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是來源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的優(yōu)點，是理想的組織工程種子細胞［1］具有多向分化和自我復制潛能,易于自體采集、無免疫排斥反應、避免倫理學限制等優(yōu)點,在細胞治療方面得到了廣泛的應用。但是BMSCs在骨髓微環(huán)境中所占比例極少,使用何種簡單操作方法快速獲取形態(tài)均一和純度較高的BMSCs便成為該研究領域關注的焦點［2］。本實驗采用全骨髓貼壁細胞培養(yǎng)法和密度梯度離心法相結合分離、純化BMSCs，通過體外培養(yǎng)擴增，以及流式細胞術鑒定，建立穩(wěn)定的BMSCs培養(yǎng)擴增方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：日本大耳白兔4只，4周齡，雌雄不限，體重250~300g，購于蘭州生物制品研究所。

1.2 主要試劑及儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(BB16UV型,德國Heraeus公司)、超凈工作臺(VS-1300L型,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限責任公司)、倒置相差顯微鏡、超聲波清洗儀、純凈水系統(tǒng)、酸度計、臺式高速離心機(北京科偉永鑫實驗儀器設備廠)、低糖培養(yǎng)基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青鏈霉素、胰酶、流式細胞抗體（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.3 兔BMSCs的采集： 取4周齡日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空針空氣栓子經(jīng)耳緣靜脈注入，待兔死亡后，將其全部浸泡于75%酒精溶液內8~10分鐘，在無菌環(huán)境下切開前后肢皮膚，切下兔前后兩肢，剃去覆蓋于肱骨、脛骨及股骨上的肌肉組織，注意保留骨的完整性，用組織剪分離股骨、脛骨及肱骨，將其置于無菌培養(yǎng)皿中，縱向依次剪開各長骨兩端，5ml注射器沿剪開的骨端注入L-DMEM沖洗3次，收集沖洗液約10ml，用篩網(wǎng)過濾沖洗液，加入完全低糖培養(yǎng)基重懸組織沖洗液，吸管反復吹打混勻，1000 r/ min ，4 ℃，離心 5 min ，棄去上清。再次加入適量完全低糖培養(yǎng)基，吹打混勻，分別加入一次性培養(yǎng)皿中，放入37℃，體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（圖1）。

1.4 兔 BMSCs 培養(yǎng)：1.4.1 原代 BMSCs 培養(yǎng) 向分離得到的細胞組織懸液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的 L-DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞，并轉移至中號塑料培養(yǎng)皿內。將培養(yǎng)皿置于37 ℃，體積分數(shù)為 5 %的 CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng) 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培養(yǎng)基換液。原代培養(yǎng) 5-7 天后，細胞融合可達 80 %以上。將原代培養(yǎng)的 BMSCs 在倒置相差顯微鏡下觀察細胞集落的形成和細胞形態(tài)（圖2）。

1.4.2 傳代 BMSCs 培養(yǎng) 待原代細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化貼壁細胞，F(xiàn)BS 終止消化后將細胞懸液以 1:3 比例接種于新培養(yǎng)瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培養(yǎng)基 5ml 培養(yǎng)，每隔 2 天換液，約 3-4 天后細胞可鋪滿瓶底。將傳代培養(yǎng)的 BMSCs 在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。以此方法，向后傳至三代（圖3、4）。

1.5 兔 BMSCs的鑒定

對干細胞的鑒定主要是建立在對細胞表面標記物的識別基礎上，采用流式細胞儀特有的細胞分析技術，可在短時間內精確分析出細胞表型以及其所占有的比例，使用間接標記法標記 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重懸，PBS 洗滌細胞 3次，向細胞懸液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀釋 1:100） 為一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗滌細胞 3 次后放入流式細胞儀中檢測。記錄數(shù)據(jù)（圖5、6）。

2 討論

BMSCs具有貼壁性、具有強大的增殖能力和多向分化潛能、具有免疫調節(jié)功能、具有來源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴增和純化，多次傳代擴增后仍具有干細胞特性，不存在免疫排斥的特性。

2.1更好地增加BMSCs的貼壁性： 在BMSCs培養(yǎng)中，細胞貼壁培養(yǎng)與傳代成功與否是本實驗的關鍵。其中存在很多問題，比如在細胞貼壁方面，用一次性塑料培養(yǎng)皿效果要優(yōu)于可重復使用的玻璃培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿。塑料培養(yǎng)皿內壁有一層鼠尾膠原，它可以更好地促使骨髓間充質干細胞貼壁。

2.2 培養(yǎng)基最佳的酸堿度： 培養(yǎng)基中加碳酸氫鈉的目的，是為了在二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡培養(yǎng)基中的PH值。對于GBICO的DMEM培養(yǎng)基，3.7g是對應二氧化碳培養(yǎng)箱的二氧化碳濃度設定在10%，而5%的則對應的是2g碳酸氫鈉。暴露在空氣中的培養(yǎng)液，因為大氣中二氧化碳的濃度很低，液體中的二氧化碳會氣體分壓高于大氣，因此會逐漸溢出，濃度逐漸降低，液體的PH值也逐漸升高，如果DMEM在空氣中存放時間過長，它將有可能變成紫紅色。一般新配置的顏色正常，在多次開蓋，培養(yǎng)液接觸空氣的時間較長后，顏色會逐漸變成紫紅色，筆者的做法是，配制培養(yǎng)液時加hepes，用小容量的分裝瓶分裝，及盡量減少培養(yǎng)液與空氣的接觸時間。配培養(yǎng)基時，將酸堿度調至6.9-7.0，過濾后酸堿度會適當增高。

2.3 傳代的注意事項

2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化時間：具筆者在試驗中的觀察，在BMSCs傳代過程中，根據(jù)培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中貼壁細胞的覆蓋率確定，當BMSCs貼壁達到80%-90%就可以傳代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差顯微鏡下觀察，當細胞70%由原來的紡錘狀、梭形變化為橢圓形時為最佳時間，一般為1至2分鐘。

2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打時間與次數(shù) ：加入EDTA-胰酶后，靜置1分鐘，在鏡下觀察細胞變橢圓或圓形，并有輕度漂浮時，用尖吸管輕輕吹打3-6次即可。

2.3.3 骨髓間充質干細胞特異性標志物： 雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)骨髓間充質干細胞特異性標志物，Pittenger等認為CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3為間充質干細胞的重要標志物［3］。

綜上所述，對 BMSCs 的形態(tài)學觀察和表型分子鑒定實驗均證實培養(yǎng)傳代的 BMSCs 的生物學特性并未發(fā)生明顯改變，說明本實驗的分離培養(yǎng)擴增方法安全有效。本實驗成功的建立了一系列分離、體外培養(yǎng)和擴增兔 BMSCs 的實驗方法，為進一步組織工程研究奠定了實驗基礎。

參考文獻

［1］ 兔骨髓間充質干細胞的體外分離培養(yǎng)和生物學特性觀察Progress in Modern Biomedicine Vol.10 NO.17 SEP.2010 3239-3243

［2］骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)及生物學特性 陳建梅姚榮偉 李勇 張馥敏 江蘇醫(yī)藥2010年10月第36卷第19期2306-2308

第9篇：干細胞培養(yǎng)技術范文

【關鍵詞】阿爾茨海默病；四乙胺；β淀粉樣多肽；神經(jīng)干細胞

基金項目：黑龍江省佳木斯大學研究生創(chuàng)新科研項目資金（項目編號：YJSCX2011021JD）；黑龍江省科學技術研究項目（項目編號：2012772）

作者單位：154000佳木斯大學阿爾茨海默病（Alzheimers disease， AD）是與衰老相關， 以嚴重的高級認知功能障礙為特征的隱襲性、逐漸性進展的退行性腦病[1，2]。AD 發(fā)病機制極其復雜， 主要病理學特點是β淀粉樣多肽（Aβ）聚集形成的老年斑（SP） 和神經(jīng)原纖維纏結 （NFT） 的形成， 伴腦皮質層神經(jīng)元減少[3，4]。在研究中發(fā)現(xiàn)，AD患者常伴發(fā)大腦海馬區(qū)的萎縮和神經(jīng)干細胞的減少。同時也證實Aβ具有神經(jīng)元毒性作用[5]和誘導神經(jīng)干細胞的凋亡[6]，Aβ誘導的神經(jīng)元凋亡的同時均伴隨鉀通道激活，尤其是延遲整流鉀電流增強[7]。TEA是鉀通道阻滯劑，研究證實心肌細胞凋亡中鉀通道阻滯劑能起到保護和抑制的作用[8]。本研究以鉀離子通道阻滯劑TEA作用于Aβl40誘導的神經(jīng)干細胞，觀察神經(jīng)干細胞存活和Caspase3活性的變化，探討Aβ致傷的神經(jīng)干細胞凋亡時鉀通道阻滯劑TEA在其中的作用。

1資料與方法

11實驗動物、主要試劑及儀器雄性 Wistar 大鼠（

12大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞的分離與傳代培養(yǎng)及鑒定新生的Wistar 大鼠（

13實驗分組實驗共分四組：Aβ140組：在傳三代后的神經(jīng)干細胞加入Aβ140 5 μM；Aβ140+TEA組：在Aβ140 5 μM孵育前30 min加入TEA 5 mM；空白對照組：加入等量的培養(yǎng)液的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)組；TEA對照組：神經(jīng)干細胞加入TEA 5 mM。上述各組分別在0 h，12 h，24 h和48 h個時間點行細胞活性及凋亡檢測。

14MTT法檢測神經(jīng)干細胞的存活率四組傳代后的神經(jīng)干細胞經(jīng)不同處理后，停止培養(yǎng)前4 h將每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μl使終濃度為 1 mg/ml，放置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用翻板法將96孔板內的培養(yǎng)基棄去，在每孔中加入溶解液 DMSO 150 μl，振蕩 10 min使其充分溶解結晶產(chǎn)物。在酶標儀上以波長570nm檢測每孔的OD值。所檢測OD值的大小可反映細胞代謝活性的強弱。每組設3個孔，實驗重復3次，細胞存活率的計算：細胞存活率=試驗組光吸收值/對照組光吸收值×100%。