淺析影響直腸癌細(xì)胞增值的因素

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一、細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞系CaCo2、HT29、HCT116、SW480、SW620、SW1116、LoVo均購(gòu)自ATCC，并由上海消化外科研究所傳代保存。LoVo采用含10％胎牛血清的F-12K培養(yǎng)傳代；CaCo2、HT29、HCT116、SW480、SW620、SW1116均使用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中，以1∶2至1∶4的比例傳代培養(yǎng)。

二、方法

1.樣本收集及免疫組化染色：結(jié)腸直腸腫瘤標(biāo)本取自上海市微創(chuàng)外科臨床醫(yī)學(xué)中心手術(shù)室。手術(shù)標(biāo)本切除后生理鹽水清洗，打開(kāi)腸腔，剔除瘤體表面壞死及炎性肉芽組織；取腫瘤中心部位及距腫瘤5cm以上的正常腸黏膜全層組織，切成1cm塊狀后置入樣本管。組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液充分固定后，制作蠟塊，切片、貼片。隨后采用鏈霉素親和素-過(guò)氧化酶復(fù)合物（SP）法進(jìn)行免疫組化染色，DAB顯色。TMPRSS4多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，1∶50稀釋。

2.半定量RT-PCR：采用Trizol試劑（Invitrogen，美國(guó)）提取細(xì)胞總RNA。電泳鑒定RNA完整性，分光光度計(jì)260nm處測(cè)定RNA濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）在ABIPrismSDS7000中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成。上海吉瑪生物有限公司合成如下引物：TMPRSS4上游引物5′-TCCAAGGACCGATCCACACT-3′，下游引物5′-AAGTTGTCGAAACAGGCAGAG-3′；GAPDH上游引物5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAA-3′，下游引物5′-TGTCATACCAGGAAATGAGC-3′。cDNA在PCR儀(AppliedBiosystems，美國(guó))中進(jìn)行反應(yīng)，50℃2min、95℃10min、95℃15s、60℃30s、72℃30s，共35個(gè)循環(huán)；然后，72℃10min，擴(kuò)增產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠中，130V、30min條件下電泳并在紫外燈下攝片，成像保存。

3.Western印跡法：細(xì)胞在10cm培養(yǎng)皿（Corning，美國(guó)）中生長(zhǎng)融合約90%時(shí)，PBS清洗2次后加入300μLRIPA，置冰上30min裂解充分后煮沸10min，隨后13000r/min離心5min。取上清液，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。每孔上樣量100μg，加入5×上樣緩沖液、去離子水至總體積一致后變性電泳（積層膠80V，分離膠120V），半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜（15V）70min后脫脂牛奶室溫封閉2h，4℃下一抗（兔抗人TMPRSS4多抗，112831-AP，Proteintech，美國(guó)，1∶600稀釋）孵育過(guò)夜。TBST洗膜3遍后加入一定比例稀釋的相應(yīng)二抗室溫孵育1h，TBST洗膜2次，PBS洗膜1次后熒光發(fā)光顯色。

4.siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)胰酶消化，計(jì)數(shù)后按每孔3×105細(xì)胞鋪6孔板，過(guò)夜。24h后按照Lipofectamine2000（Invitrogen，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。由上海吉瑪生物有限公司設(shè)計(jì)并合成TMRPSS4-siRNA序列：5′-AAGUUGUCGAAACAGGCAGAGAACC-3′（si組）。僅轉(zhuǎn)染Lipo2000的細(xì)胞為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列的細(xì)胞為陰性對(duì)照組（NC組）。轉(zhuǎn)染48h后用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，72h提取總蛋白質(zhì)。

5.CCK-8測(cè)細(xì)胞增殖：取轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞計(jì)數(shù)后鋪于96孔板，每孔100個(gè)；設(shè)干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔。在第0、24、48、72、96和120h，分別于各孔加入CCK-8試劑（cellcountingkit-8，Dojindo,日本）10μL，37℃孵育2.5h，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm的吸光度值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

6.AnnexinⅤ/PI流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染48h后收細(xì)胞，取100μL細(xì)胞懸液（1×106個(gè)/mL）至流式管，用PBS洗滌1次，離心后加入300μL結(jié)合緩沖液，混勻，再加入5μL的AnnexinⅤ-FITC和5μL的PI，孵育15min后用流式細(xì)胞儀（BD，美國(guó)）上機(jī)檢測(cè)。

7.劃痕試驗(yàn)：6孔板轉(zhuǎn)染，待細(xì)胞鋪滿后，用無(wú)菌槍頭每孔筆直劃線，PBS清洗3次，加入無(wú)血清培養(yǎng)液置培養(yǎng)箱孵育。24h后在顯微鏡下每孔隨機(jī)選取視野觀察攝片。

8.transwell遷移試驗(yàn)：取轉(zhuǎn)染24h后細(xì)胞，無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液重懸后計(jì)數(shù)，調(diào)至終密度為5×105個(gè)/mL。24孔板每孔內(nèi)加入900μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，隨后置入transwell小室（Corning，美國(guó)），小室內(nèi)加入200μL細(xì)胞懸液（105個(gè)細(xì)胞）。培養(yǎng)箱孵育24h后取出，棉簽拭去內(nèi)室面細(xì)胞，甲醇固定小室外穿出細(xì)胞10min，1%結(jié)晶紫染色10min，PBS清洗3遍后，顯微鏡下觀察攝片。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.免疫組化檢測(cè)TMPRSS4蛋白在結(jié)腸直腸癌組織和正常腸上皮中表達(dá)標(biāo)本免疫組化染色顯示，TMPRSS4蛋白定位于細(xì)胞膜上，在腫瘤組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中均染色陽(yáng)性，且轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中TMPRSS4蛋白染色更強(qiáng)。表明TMPRSS4表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞遷移能力有一定相關(guān)性。

2.半定量RT-PCR和Western印跡檢測(cè)TMPRSS4在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TMPRSS4基因在7株結(jié)腸癌細(xì)胞中有不同程度的表達(dá)，其中在HT29、SW480、SW620、SW1116中的表達(dá)相對(duì)較高。Western印跡檢測(cè)亦有類似結(jié)果，有細(xì)胞均不同程度表達(dá)TMPRSS4蛋白，而HCT116、SW480和SW1116蛋白表達(dá)量相對(duì)較高。因此，本研究決定選用SW480細(xì)胞進(jìn)行下一步試驗(yàn)。三、siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞中TMPRSS4蛋白表達(dá)下調(diào)在轉(zhuǎn)染siRNA48h后，Western印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組和NC組相比，siRNA干擾組（si組）的TMPRSS4蛋白表達(dá)明顯下降。

3.TMPRSS4下調(diào)可顯著抑制SW480細(xì)胞的增殖能力siRNA處理SW480細(xì)胞株后，采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖能力。在第1、2、3、4、5天不同時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)定吸光度值，吸光度值可間接反映細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱。與空白對(duì)照組和NC組相比，si組細(xì)胞增殖能力在48~96h時(shí)受到明顯抑制（P<0.05)。

4.下調(diào)TMPRSS4誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡SW480細(xì)胞株轉(zhuǎn)染TMPRSS4siRNA后孵育48h，收集細(xì)胞，用AnnexinⅤ/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞周期，si組細(xì)胞凋亡比值為14.0%，而空白對(duì)照組和NC組分別為10.4%和10.1%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。提示下調(diào)TMPRSS4可能有誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用。

5.siRNA干擾TMPRSS4表達(dá)顯著影響SW480細(xì)胞的遷移能力采用siRNA處理SW480細(xì)胞后，進(jìn)行細(xì)胞劃痕及transwell遷移試驗(yàn)。結(jié)果顯示，si組的SW480細(xì)胞在劃痕試驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)能力比對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；si組在transwell試驗(yàn)中的穿膜細(xì)胞數(shù)亦比對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。

四、討論

Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶是一類新近發(fā)現(xiàn)的特殊蛋白酶，具有明顯的組織表達(dá)特異性，且與耳聾、貧血、高血壓和腫瘤等的發(fā)生相關(guān)。本研究探討該家族成員TMRPSS4在結(jié)腸直腸癌組織中的表達(dá)及其對(duì)增殖、凋亡、遷移等方面的影響。采用siRNA干擾TMPRSS4表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖能力減弱，同時(shí)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力也降低，這與Jung等先前的研究結(jié)果相一致。針對(duì)該蛋白質(zhì)的其他研究表明，TMPRSS4可能通過(guò)作用于細(xì)胞間黏附分子或激活其他蛋白酶在組織發(fā)育和細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用；并通過(guò)發(fā)揮其蛋白酶的水解作用裂解病毒表面的紅細(xì)胞凝集素，促進(jìn)病毒在肺部的擴(kuò)散而致病。因此，推測(cè)該基因可能通過(guò)靶向作用于細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞-細(xì)胞間連接分子而在調(diào)控SW480細(xì)胞的增殖及遷移中發(fā)揮作用，具體機(jī)制尚有待后續(xù)研究來(lái)揭示。同時(shí)，流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示，在siRNA干擾后，SW480細(xì)胞的凋亡比例明顯增加，這與干擾后細(xì)胞的增殖能力降低相一致，表明敲除TMPRSS4基因可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制增殖。最近有研究表明，乳腺癌中TMPRSS4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期差、腫瘤體積大以及總生存率和無(wú)病生存率低相關(guān)。本研究初步顯示，TMPRSS4在結(jié)腸直腸癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中有不同程度表達(dá)，且轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)染色強(qiáng)度略高。因此，有必要進(jìn)一步探討TMPRSS4與結(jié)腸直腸癌病理分期、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病人預(yù)后間的相關(guān)性，為其作為預(yù)后預(yù)測(cè)因素提供依據(jù)。我們將繼續(xù)探討TMPRSS4對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲方面的具體作用機(jī)制，揭示這一基因?qū)τ诮Y(jié)腸直腸癌發(fā)生、發(fā)展的作用。

作者：黃傲 周厚民 趙紅超 全應(yīng)軍 金潤(rùn)森 樂(lè)飛 馬君俊 馮波 鄭民華 單位：上海交通大學(xué)青島市市立醫(yī)院