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一、材料和方法
(一)卵泡的采集和組織切片。
從有規(guī)則產(chǎn)蛋周期的三黃母雞中取出等級前卵泡,按照其直徑分為小白卵泡(SWF,1~3mm)、大白卵泡(LWF,3~5mm)、小黃卵泡(SYF,5~6mm)和大黃卵泡(LYF,6~9mm)。各級卵泡用4%多聚甲醛固定24h,然后切片,片厚5μm。經(jīng)HE染色后在顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)并用顯微數(shù)字成像系統(tǒng)攝像,將圖像傳送到計算機中。用SimplePCI高級圖像分析軟件測量卵泡顆粒層和膜層的厚度,以及顆粒細胞的密度。
(二)卵泡的培養(yǎng)和激素處理
等級前卵泡取出后,用生理鹽水漂洗干凈,以1卵泡/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板。根據(jù)卵泡直徑將發(fā)育階段相近的卵泡隨機分為2組,即對照組和FSH處理組。培養(yǎng)液為含0.5%胎牛血清(FCS)的M199培養(yǎng)液(Hyclone)。預(yù)培養(yǎng)16h后,撤去血清,換用含10μg/mL胰島素、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10-8mol/L亞硒酸鈉的ITS培養(yǎng)液。培養(yǎng)液還添加了1.75mmol/LHepes、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。卵泡置于39℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)的同時用10ng/mLFSH處理48h。每個處理組4孔,實驗重復(fù)3次。
(三)5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷免疫組織化學(xué)
卵泡懸浮培養(yǎng)48h后加入終濃度為15μg/mL的BrdU,繼續(xù)培養(yǎng)4h,然后用4%多聚甲醛固定,進行切片。切片用3%H2O2溫育30min滅活內(nèi)源性過氧化物酶,室溫下用山羊血清封閉20min后加入甲酰胺100℃變性核酸5min,冰水浴冷卻后,加入小鼠抗BrdU抗體,4℃過夜后滴加羊抗鼠IgG二抗,37℃孵育20min,用DAB顯色劑室溫顯色,陽性細胞呈棕紅色,計算出陽性細胞的百分比。
(四)數(shù)據(jù)分析
所得數(shù)據(jù)采用SAS軟件中GLM過程進行方差分析和Duncan氏多重比較,檢驗誤差為5%和1%水平。
二、實驗結(jié)果
(一)等級前卵泡膜層和顆粒層的形態(tài)學(xué)變化
等級前卵泡組織學(xué)研究結(jié)果表明,SWF只有1層顆粒細胞,LWF中出現(xiàn)2層顆粒細胞,而SYF和LYF中則有多層顆粒細胞?;ね鈧?cè)的結(jié)締組織分化形成卵泡膜層,其中的膜細胞則隨著卵泡級別的增加而成為多層,并分化為內(nèi)膜細胞層和外膜細胞層。同時數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示,卵泡膜層和顆粒層厚度隨著卵泡直徑的變大而顯著增加,并且顆粒細胞的密度也呈現(xiàn)相似的變化趨勢
(二)等級前卵泡顆粒細胞BrdU標記指數(shù)的變化
等級前卵泡BrdU摻入實驗結(jié)果表明,隨著卵泡直徑增加,顆粒細胞BrdU標記指數(shù)顯著增加,即顆粒細胞的增殖活性隨等級前卵泡的發(fā)育而增強。
(三)FSH對卵泡細胞增殖的影響
等級前卵泡用10ng/mLFSH處理48h,然后進行的組織學(xué)研究和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果表明,與對照組相比,F(xiàn)SH處理組LYF中顆粒層的厚度增厚19.7%。隨著FSH處理劑量的增加,SYF和LYF中顆粒細胞的密度分別增加25.7%和30.3%。但是在卵泡體外培養(yǎng)過程中,F(xiàn)SH處理后卵泡膜層的厚度則沒有顯著變化。
三、結(jié)論
卵巢中卵泡是生長最快的正常組織之一,而與卵母細胞一起構(gòu)成卵泡的體細胞的發(fā)育則是其生長的主要原因。本實驗對產(chǎn)蛋母雞等級前卵泡的組織切片結(jié)果顯示了小卵泡中卵泡細胞的發(fā)育進程。SWF僅有1層立方狀的顆粒細胞,與卵母細胞組成初級卵泡;LWF、SYF和LYF中顆粒層細胞增至2~3層,并且顆粒細胞數(shù)目顯著增加,從而形成次級卵泡。本實驗還顯示,隨著卵泡體積的增加,膜細胞增殖為多層并分化為功能完全不同的內(nèi)膜細胞和外膜細胞層。以上結(jié)果表明卵泡體細胞的生長變化是卵泡發(fā)育的重要標志。FSH在維持和調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育中起著重要作用。FSH可促進卵巢顆粒細胞的增殖。用碘化FSH作自顯攝研究證實,F(xiàn)SH的結(jié)合部位首先出現(xiàn)在顆粒細胞,可見卵巢中主要是顆粒細胞表達FSH受體。FSH以劑量-效應(yīng)關(guān)系促進雞顆粒細胞的增殖。最近的研究報道,F(xiàn)SH通過Akt信號途徑上調(diào)細胞周期蛋白D2的表達和抑制AMPK的活性,最終刺激顆粒細胞的增殖。本實驗采用體外卵泡懸浮培養(yǎng),研究了FSH對卵泡細胞增殖的影響。結(jié)果表明,10ng/mLFSH顯著增加SYF和LYF中顆粒層的厚度以及顆粒細胞的密度,但FSH對卵泡膜細胞則沒有顯著的促增殖作用。由此可見,F(xiàn)SH對小卵泡的發(fā)育具有階段和細胞類型特異性,即FSH顯著促進即將進入等級前卵泡中顆粒細胞的增殖,從而加速卵泡的發(fā)育。總之,本實驗通過體內(nèi)和體外研究顯示了等級前卵泡中膜細胞和顆粒細胞的形態(tài)學(xué)變化,并證明FSH能顯著刺激SYF和LYF中顆粒細胞的增殖,促使等級前卵泡進入等級發(fā)育。