反向遺傳學(xué)研究方法精選(九篇)

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第1篇：反向遺傳學(xué)研究方法范文

關(guān)鍵詞 病毒學(xué) 方法 分子細(xì)胞水平

中圖分類號：G644 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

相對動物學(xué)或者植物學(xué)這些傳統(tǒng)學(xué)科，病毒學(xué)是一門始創(chuàng)于20世紀(jì)40年代的新興學(xué)科。雖然在此之前，就有發(fā)現(xiàn)能通過細(xì)菌過濾器的煙草花葉病致病因子的科學(xué)家D.Ivanofsky，以及發(fā)現(xiàn)具有濾過性的口蹄疫病原的科學(xué)家Loeffler和Frosch，但是基于歷史條件和知識水平的限制，人們或許觀察到了病毒引起的自然現(xiàn)象，卻無法對其產(chǎn)出真正科學(xué)的認(rèn)識。

病毒學(xué)的里程碑事件應(yīng)屬1935年美國科學(xué)家Stanley對于煙草花葉病毒的提純，使人們不再空泛地想象病毒的存在，而是真切地觀察和接觸到病毒，為今后的研究開辟了廣闊的道路。隨后，觀察手段，培養(yǎng)方法，以及相關(guān)的病理性研究手段的不斷提升，也使得病毒學(xué)這樣一門起步較晚的學(xué)科開始了飛速發(fā)展。

回顧病毒學(xué)研究的發(fā)展歷程，不難發(fā)現(xiàn)，學(xué)科的發(fā)展很大程度上依賴于技術(shù)的進(jìn)步與革新，以及與相關(guān)學(xué)科的借鑒與學(xué)習(xí)。故了解和掌握病毒學(xué)方法技術(shù)的發(fā)展歷史以及技術(shù)要求，對于學(xué)科的研究，以及技術(shù)的創(chuàng)新，都有諸多裨益。

1 病毒鑒定檢測的相關(guān)方法技術(shù)

對于病毒最直觀的認(rèn)識無疑是其生物學(xué)上特征，如病毒的理化性質(zhì)（如病毒粒子的形態(tài)、大小、對理化因子的耐受性、特外存活期等）以及在寄主上的反應(yīng)（如寄主范圍、癥狀表現(xiàn)、傳播方式等）。目前，病毒生物學(xué)特征的研究鑒定方法主要分為三大類：顯微成像技術(shù)（或相關(guān)針對病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察的技術(shù)）、免疫-血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。

1.1 病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察技術(shù)

眾所周知，病毒顆粒的大小遠(yuǎn)小于普通細(xì)菌，所以對病毒最直觀的鑒定方法就是使用電鏡觀察，它可以直接地看到病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、存在與否。自第一臺電子顯微鏡的誕生，這門技術(shù)已為病毒學(xué)在內(nèi)的多種生物學(xué)科作出了重要的貢獻(xiàn)，優(yōu)點也十分明顯，操作簡便，快捷有效，所以，即使是在進(jìn)入了分子研究水平的今天，電子顯微鏡仍然發(fā)揮著它不可替代的作用。

另外，在原始的技術(shù)基礎(chǔ)之上加以改進(jìn)也形成了一些針對特殊觀察對象的電鏡技術(shù)，如電鏡負(fù)染技術(shù)和免疫電鏡檢測技術(shù)等。低溫電鏡技術(shù)，就是一種結(jié)合電鏡技術(shù)和低溫結(jié)晶觀察病毒的三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)，其優(yōu)點不僅在于其分辨率更高，而且對于病毒樣品的損傷和失真的概率都大大減小，常用于極微量和高保真要求的病毒觀察檢測。

X-射線衍射技術(shù)是通過掃射病毒微晶得到的衍射圖像來分析還原原始的病毒結(jié)構(gòu)，但為了保證衍射圖像的準(zhǔn)確性，往往對樣品的純度和顆粒完整性要求較高，所以這種技術(shù)的使用范圍相對受限。

核磁共振技術(shù)，相對于前面提到的技術(shù)，對于操作的要求更低，運(yùn)用范圍也更廣，但是對于結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性判斷略低。此技術(shù)主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子構(gòu)象變化的研究。

1.2 免疫-血清檢測方法

此類技術(shù)的原理主要根據(jù)病毒的侵染性以及其作為白的特性而設(shè)計的。運(yùn)用最為廣泛的還是血清學(xué)測試，即利用血清中可以和具有某種特定結(jié)構(gòu)特征的病毒結(jié)合的抗體，從而進(jìn)行病毒的定性定量分析。此法也廣泛應(yīng)用用于醫(yī)學(xué)臨床的診斷，操作簡便，低廉有效。

酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）也是利用特異抗體吸附病毒顆粒的原理，只是在抗體上附帶了酶標(biāo)記，從而使反應(yīng)可以有顏色強(qiáng)弱的變化，利于定時定量監(jiān)測病毒濃度。此法靈敏度高，且不受濃度范圍或其他抑制劑的干擾，也越來越多地應(yīng)用于相關(guān)的生產(chǎn)實踐中。

免疫組化技術(shù)也是將抗體帶上特殊的顯色基團(tuán)，使其游離時不顯色，而于抗原物質(zhì)結(jié)合后顯色。利用這個特點，可以檢測特定組織中不同區(qū)域的病毒含量已經(jīng)分布特點，利于進(jìn)行組織性毒理分析。

1.3 分子生物學(xué)檢測方法

病毒寄生在宿主細(xì)胞內(nèi)，但它又有不同于宿主細(xì)胞的特異基因組序列，特異序列的存在就說明病毒的存在，這就是分子生物學(xué)檢測病毒的原理。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是其中最為常用的一種檢測手段，其原理即利用DNA半保留復(fù)制的特點，以原始DNA為模板合成兩條一樣的雙鏈，從而達(dá)到擴(kuò)增量指數(shù)增長，DNA總量可檢測的目的。另外，由于病毒的核酸有的是DNA，有的是RNA，所以常規(guī)的PCR以及反轉(zhuǎn)錄PCR即可針對不同的病毒基因進(jìn)行檢測。

實時定量PCR與傳統(tǒng)PCR基本相同，只是在體系中加入熒光基團(tuán)，反應(yīng)中利用CCD實時讀取熒光信號，檢測。不僅減少的污染和浪費，也使定量快速而方便，可以實現(xiàn)多樣品和高通量的反應(yīng)。

核酸原位雜交的原理是利用生物素編輯的cDNA探針來雜交組織中的樣本，從而確定病毒在宿主中的分布和載毒量。該技術(shù)，往往與免疫組化一起使用。

dsRNA技術(shù)是利用dsRNA在一定條件下與纖維素特異結(jié)合的性質(zhì)，從來快速簡便的提取檢測出病毒顆粒中的dsRNA等，高效準(zhǔn)確，在普通實驗室和生產(chǎn)工廠中都有所應(yīng)用。

2 病毒的分離與培養(yǎng)的相關(guān)技術(shù)方法

2.1 病毒的提純技術(shù)

作為病毒學(xué)研究的重要技術(shù)前提，病毒的提純質(zhì)量往往影響了后續(xù)一系列的步驟，所以其重要性不言而喻。由于病毒的生長特性、理化性質(zhì)和宿主都差異頗大，提純的方法也不盡一致。

在病毒研究初期，沉淀法最常被使用，其主要利用病毒的蛋白外殼，改變?nèi)軇┬再|(zhì)，從而分離病毒粒子。相對而言簡便快速，但也常存在粗糙易變性的缺點。

色譜法源于化學(xué)中多組分的分離，由于生物成分的多樣性，也常使用該技術(shù)。色譜法主要分為吸附法、柱層析法和電泳法，都是利用較為溫和的環(huán)境，以及病毒的特異吸附或凝集等特質(zhì)而設(shè)計的技術(shù)。種類繁多，應(yīng)用廣泛。

超速離心利用樣品中不同成分擁有不同的沉降系數(shù)，在離心過程中，不同成分會在溶劑的特定位置形成區(qū)帶，從而達(dá)到分離提純的目的。此法常使用生物活性溶劑，且離心本身對病毒粒子損傷較小，故常用于理想的病毒快速分離技術(shù)。

2.2 病毒的獲取

最初的植物病毒學(xué)和動物病毒學(xué)的諸多研究都是建立在活的宿主體系上的，并且至今仍在應(yīng)用，如生產(chǎn)不能體外繁殖的病毒、研究病毒感染的病理作用、檢測疫苗的安全性等。但動物宿主體系存在太多弊病，隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，有逐漸被淘汰的趨勢。

現(xiàn)在，病毒的獲取主要是三種途徑：從宿主直接獲取、感染宿主擴(kuò)增病毒、直接合成，其中后兩種途徑使用更為廣泛。

感染宿主擴(kuò)增病毒即要使用到組織細(xì)胞培養(yǎng)，這項技術(shù)本來屬于細(xì)胞學(xué)的范疇，后由于動物源性或者細(xì)菌源性的病毒研究需求，此技術(shù)也越來越多地應(yīng)用于病毒學(xué)的研究中。如，空斑分析最初用于測定噬菌體含量，而今也逐漸普及為動物病毒的研究中去。

直接合成法則是利用動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將病毒的遺傳信息整合進(jìn)目標(biāo)動物中，在動物體內(nèi)完成基因的表達(dá)，蛋白的合成，以及病毒的組裝等步驟。而動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)也是現(xiàn)今生物領(lǐng)域的熱點內(nèi)容，技術(shù)繁多，更新迅速，也為病毒的研究提供了良好的基礎(chǔ)。

3 病毒的功能機(jī)制研究的相關(guān)技術(shù)方法

3.1 病毒的遺傳學(xué)的研究

關(guān)于病毒遺傳學(xué)的研究和細(xì)菌等微生物的遺傳學(xué)研究技術(shù)相似，如PCR等。但是病毒的遺傳物質(zhì)除了可能是DNA還可能是RNA，而且現(xiàn)在對于RNA病毒的研究居多，所以針對性的技術(shù)也與細(xì)菌等微生物的遺傳學(xué)研究技術(shù)有所區(qū)別。

對于RNA病毒使用最多的是反向遺傳學(xué)技術(shù)，最初即使用反轉(zhuǎn)錄PCR得到病毒RNA的cDNA，從而完成病毒基因組的探索工作，以達(dá)到了解或有目的性改造病毒基因組實現(xiàn)生產(chǎn)應(yīng)用的目的。此法對于類型多樣的病毒研究提供的最為基礎(chǔ)的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為疫苗開發(fā)篩選、新型病毒載體等多方面都給予有力的技術(shù)支持。

針對病毒易變異的特點，單鏈構(gòu)想多態(tài)性檢測技術(shù)（SSCP）則理想地解決了這一問題。近年來，對于多種模式生物的基因組測序的發(fā)展，越來越多的研究開始著重于探索基因變異的問題，而SSCP技術(shù)正是這樣發(fā)展起來的。其主要用于檢測基因點突變和短序列的缺失和插入，為病毒的分子演化規(guī)律以及流行病學(xué)提供充分的證據(jù)。

基因芯片技術(shù)的概念來源于計算機(jī)芯片，即將大量寡聚核苷酸以陣列形式有序固定于載體表面，與待測樣本的病毒分子雜交，然后利用化學(xué)發(fā)光或同位素等顯色方法，用CCD等儀器對雜交信號進(jìn)行高效檢測分析。主要用于病毒基因表達(dá)譜和基因多態(tài)性等方面的研究。

3.2 病毒表達(dá)機(jī)制的研究

在病毒的表達(dá)機(jī)制研究中，主要是利用不同的檢測手段，判斷病毒表達(dá)的具體情況，并對于病毒表達(dá)的情況進(jìn)行總結(jié)歸納，研究其時空上的機(jī)制和規(guī)律。

Northern Blots即針對病毒RNA樣品的技術(shù)手段，原理與Southern Blots相似，利用探針與固相RNA雜交，再對探針分子的圖像進(jìn)行捕獲和分析。此法特異性高，常用于分析已知基因的表達(dá)情況。

mRNA表達(dá)差異技術(shù)主要使用反轉(zhuǎn)錄PCR以及等量不同宿主的定量檢測，來確定抗病種和感病種的差異表達(dá)基因，從而進(jìn)一步確定造成品種差異的原因。

3.3 病毒蛋白質(zhì)的研究

病毒蛋白決定了病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)，常作為抗原來激發(fā)人體內(nèi)的免疫反應(yīng)，作用于宿主細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致宿主細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生紊亂；并且一些病毒蛋白具有酶的作用，可作為細(xì)胞毒素作用于宿主細(xì)胞。

大范圍而言，病毒蛋白質(zhì)研究的技術(shù)，都隸屬于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范疇之內(nèi)，只不過針對不同特性的蛋白，往往會選取最為有效而簡便的技術(shù)方法進(jìn)行研究。而由于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)生物特性等多方面差異很大的特點，其針對性技術(shù)也是五花八門，在此僅列舉較為常用的技術(shù)，以供研究者學(xué)習(xí)參考。

經(jīng)典的方法有親和層析、抗體受體法、抗細(xì)胞受體法、抗獨特型抗體法、病毒覆蓋蛋白法。大多還是利用病毒蛋白和抗體蛋白或者其他蛋白或大分子物質(zhì)的作用，來檢測病毒蛋白的特性。雖然這些方法快速簡便，但是由于方法本身較為粗糙，樣品用量較大，準(zhǔn)確性存疑等問題，現(xiàn)在僅在低要求情況下使用。

現(xiàn)代的方法則更加豐富，也分別具有各自的特點，常被運(yùn)用于現(xiàn)在的病毒蛋白的研究。

噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)是利用噬菌體本身表達(dá)的兩種結(jié)構(gòu)蛋白會暴露在噬菌體表面，故將外源基因倒入兩個結(jié)構(gòu)蛋白基因間，使外源序列一起表達(dá)，然后讓表達(dá)產(chǎn)物與大量配體結(jié)合，篩選特殊結(jié)合性配體。但此法表達(dá)出來的蛋白可能與天然狀態(tài)不符，所以使用較為受限。

免疫共沉淀是一種成熟蛋白作用技術(shù)，其原理為在溶液或細(xì)胞中，用一種蛋白的抗體耦合可與此蛋白特異結(jié)合的另一蛋白，從而形成一抗體兩蛋白的沉淀，從而獲取具有結(jié)合餌蛋白能力的未知蛋白，探索細(xì)胞中蛋白作用機(jī)制。

酵母雙雜交技術(shù)是利用真核基因的特殊表達(dá)機(jī)制，通過將兩個蛋白的編碼序列整合在同一酵母細(xì)胞內(nèi)的特殊轉(zhuǎn)錄激活域附近，若兩種蛋白可以發(fā)生相互作用，則會激活相應(yīng)的報告基因，從而報告蛋白的相互作用。此法常用于篩選病毒蛋白的特異膜蛋白受體。

除了以上列舉的技術(shù)之外，還有cDNA文庫技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)、GST Pull-down技術(shù)、串聯(lián)親和純化、熒光能量共轉(zhuǎn)移等多種技術(shù)應(yīng)用于蛋白互作的研究。

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第2篇：反向遺傳學(xué)研究方法范文

【關(guān)鍵詞】 基質(zhì)金屬蛋白酶9;RNA干擾;慢病毒載體

【Abstract】 Objective To explore the silencing effect of the constructed mice′s matrix metalloproteinase (MMP)9 RNA interference (RNAi) lentivirus vector in vitro. Methods 293T and NIH3T3 cells were cocultured by MMP9 overexpressed clone plasmid and RNAi lentivirus vector. Real time PCR and Western blot were adopted to observe the downregulation of MMP9 mRNA expression in 293T and NIH3T3 cells by RNAi. Results The constructed MMP9 RNAi lentivirus vector significantly decreased MMP9 expression in 293T and NIH3T3 cells. Conclusions RNAi lentivirus vector inhibiting MMP9 expression is successfully constructed， laying foundation for the research in vivo.

【Key words】 Matrix metalloproteinase (MMP)9; RNA interference; Lentivirus vector

動脈粥樣硬化(AS)斑塊破裂是急性缺血事件的主要原因。細(xì)胞凋亡和基質(zhì)降解機(jī)制與斑塊破裂過程有關(guān)〔1〕。循環(huán)中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)標(biāo)記物的水平常常與AS疾病的危險分層密切相關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)降解ECM，破壞動脈壁的完整性，觸發(fā)急性動脈血栓形成〔2〕。MMPs是與ECM蛋白質(zhì)降解密切相關(guān)的蛋白水解酶，在組織重塑過程中起重要作用〔3〕，是造成AS斑塊不穩(wěn)定的重要原因之一。不穩(wěn)定的人AS斑塊局部MMPs的主要來源為單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，而MMPs的主要成分是MMP2和9〔4〕。因此，抑制MMP9在不穩(wěn)定斑塊中的表達(dá)，可能抑制斑塊破裂。為此，本實驗構(gòu)建小鼠MMP9 RNA干擾(RNAi)質(zhì)粒，采用Western印跡和實時熒光定量PCR法，驗證MMP9干擾質(zhì)粒在工具細(xì)胞中的沉默效應(yīng)，為進(jìn)一步在體研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 由上海吉凱基因有限公司構(gòu)建合成并包裝的MMP9 RNAi慢病毒載體;DMEN、胎牛血清(Gibco公司);胰蛋白酶(上?；瘜W(xué)試劑公司);Lipofectamine2000、Trizol(美國Invitrogen公司);兔GFP多克隆(Abcam公司);山羊抗兔IgGHRP(Santa Cruz公司);預(yù)染的蛋白標(biāo)志物(中晶公司);熒光顯微鏡(Olympus公司);實時熒光定量PCR儀器(BioRad公司)。

1.2 方法

1.2.1 Western印跡檢測293T細(xì)胞中MMP9表達(dá) 將構(gòu)建好的MMP9基因過表達(dá)克隆質(zhì)粒和針對不同靶點RNAi病毒載體質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后72 h，收集培養(yǎng)上清行12%SDS聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用TBST(TBS+0.05%Tween20)加5%脫脂奶封閉過夜;用含5%脫脂牛奶的TBST稀釋與一抗相應(yīng)的辣根過氧化物酶驢抗小鼠二抗(1∶4 000)，于室溫下孵育2 h，用Amersham公司ECL+plusTM Western印跡試劑盒檢測蛋白表達(dá)。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測NIH3T3細(xì)胞中MMP9 mRNA的表達(dá) NIH3T3細(xì)胞慢病毒感染實驗在6孔板中進(jìn)行，分為正常對照組、陰性對照組和RNAi組。MMP9基因引物采用Beacon designer 2軟件設(shè)計，上游引物：GGCGTGTCTGGAGATTCG，下游引物：TACTGGAAGATGTCGTGTGAG;分別取轉(zhuǎn)染后的NIH3T3細(xì)胞，按Invitrogen公司的Trizol操作說明書抽提細(xì)胞總RNA;RNA逆轉(zhuǎn)錄獲cDNA，在Biorad的iQ5上完成實時熒光定量PCR檢測。

1.2.3 熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá) 將生長狀態(tài)良好的NIH3T3，在病毒感染前一天分入6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，感染當(dāng)天按實驗設(shè)計的組別分別加入不同復(fù)合感染(MOI)的RNAi慢病毒顆粒進(jìn)行感染實驗。感染72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，進(jìn)而判斷MMP9的干擾效果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 293T細(xì)胞中Western印跡鑒定慢病毒介導(dǎo)的RNAi 于轉(zhuǎn)染后72 h，收集培養(yǎng)上清作Western印跡檢測，利用0.25和0.5 μg兩種不同質(zhì)粒濃度進(jìn)行實驗。1#、2#、3#這三種不同干擾靶點的敲減作用不同，2#對MMP9有顯著的敲減作用，在兩個質(zhì)粒濃度下的作用是一致的;3#也有一些敲減作用，特別是在高質(zhì)粒濃度下;1#靶點基本沒有作用，如圖1。

PC為MMP9陽性參照;NC1為共轉(zhuǎn)染過表達(dá)融合蛋白質(zhì)粒，加NC RNAi質(zhì)粒的細(xì)胞組;NC2為針對鼠源GAPDH的有效干擾載體，作為第二個陰性對照;1#、2#、3# 為共轉(zhuǎn)染過表達(dá)融合蛋白質(zhì)粒，不同靶點加RNAi質(zhì)粒的細(xì)胞組

圖1 Western 印跡檢測293T細(xì)胞中RNAi作用

2.2 實時熒光PCR定量檢測NIH3T3中MMP9 mRNA的干擾作用 分別提取轉(zhuǎn)染后的NIH3T3細(xì)胞總RNA，利用實時熒光PCR定量分析各組MMP9 mRNA表達(dá)量的變化。RNAi組MMP9 mRNA相對表達(dá)量為0.25，陰性對照組為1.00，正常對照組為1.52。RNAi組在NIN3T3細(xì)胞上對MMP9 mRNA基因表達(dá)有顯著干擾作用，干擾效率75%以上，與其他兩組比較有顯著差異(P

2.3 NIH3T3細(xì)胞感染病毒的熒光觀察 慢病毒載體上帶有GFP綠色熒光基因標(biāo)記，在488 nm藍(lán)光照射下可激發(fā)出507 nm的綠色熒光。感染72 h后在熒光顯微鏡下可見，陰性對照組幾乎100%的NIH3T3細(xì)胞都可發(fā)出綠色熒光，說明MMP9過表達(dá)質(zhì)粒大量轉(zhuǎn)染入NIH3T3細(xì)胞;慢病毒介導(dǎo)的RNAi組綠色熒光表達(dá)明顯減少，說明慢病毒介導(dǎo)的RNAi能夠有效抑制MMP9表達(dá)。見圖2。

圖2 RNAi靶點驗證熒光圖

3 討 論

基因治療的關(guān)鍵在于篩選有效基因、構(gòu)建高效表達(dá)載體、定位靶向治療。以往實驗研究中常用的載體有腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。腺病毒載體是基因治療常用的病毒載體，具有感染能力強(qiáng)、滴度高、多拷貝高效性、無插入突變性等優(yōu)點〔5〕，但是目的基因不能整合至靶細(xì)胞基因組，僅能短暫表達(dá)，且反復(fù)應(yīng)用容易引起免疫反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體雖然可以使目的基因整合至靶細(xì)胞基因組，實現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，但只能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂期細(xì)胞，不能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂期細(xì)胞。慢病毒載體來源于人類免疫缺陷病毒1(HIV1)，具有可感染非分裂期細(xì)胞、容納外源性目的基因片段大、免疫反應(yīng)小等特點，因此越來越受到人們重視。

RNAi是雙鏈RNA分子在mRNA水平上誘發(fā)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)沉默〔6，7〕。作為一種反向遺傳學(xué)手段，RNAi廣泛應(yīng)用于基因功能分析、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究和基因治療之中。由于慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi 作用時間持久，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，因此慢病毒成為基因治療載體研究的熱點。 用慢病毒載體介導(dǎo)RNAi的研究〔8～10〕顯示，該技術(shù)在基因功能和基因治療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

MMPs是活性依賴于內(nèi)源性Zn2+及Ca2+的存在、主要由平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌和表達(dá)的一類蛋白水解酶，目前發(fā)現(xiàn)有16種以上。Peter等〔11〕的研究顯示，巨噬細(xì)胞過表達(dá)活化的MMP9時顯著增加彈力蛋白的降解，誘導(dǎo)有效的斑塊破裂。因此，抑制MMP9的表達(dá)可能對AS的進(jìn)程及不穩(wěn)定斑塊的破裂產(chǎn)生重要影響。

本實驗以MMP9為干擾靶點構(gòu)建的慢病毒載體，在生長狀態(tài)良好的工具細(xì)胞中，通過Western印跡和實時熒光定量PCR驗證其靶點的有效性，結(jié)果顯示構(gòu)建的慢病毒載體能夠有效敲減工具細(xì)胞中MMP9表達(dá)。這為以后的動物體內(nèi)基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。

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第3篇：反向遺傳學(xué)研究方法范文

關(guān)鍵詞：小麥；白粉病；WRKY；VIGS

中圖分類號：S512 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.001

Abstract：WRKY transcription factor family can help improve plant stress tolerance， which widely exist in various plants. After TaWRKY gene was silenced by VIGS method， it was found that the proportion of succeed Bgt inoculation increased， and the percentage of abnormal appressoria declined， such as papilla. The results indicated that TaWRKY gene played an important role in wheat- Bgt interaction.

Key words：wheat； powdery mildew； WRKY； VIGS

小麥白粉病是由布氏白粉菌（Blumeria graminis f. sp. Tritici）侵染所引起的真菌感染性病害，如遇高溫多濕天氣病害流行，會使小麥嚴(yán)重受害，導(dǎo)致減產(chǎn)13%～34%[1]。 因此，科學(xué)家一方面通過抗病育種，不斷培育新的抗病小麥品種來抵御病害，另一方面通過深入的抗病分子機(jī)理研究，克隆抗病相關(guān)基因、弄清抗病信號通路以及基因工程等技術(shù)手段，以達(dá)到抗病分子育種的目的。

轉(zhuǎn)錄因子可以與真核基因啟動子區(qū)中的順式作用元件互作，激活或抑制多個下游功能基因轉(zhuǎn)錄，從而使植株獲得綜合改良效果。研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族幾乎存在于所有植物中，它們共同含有一段高度保守氨基酸序列WRKYGQK[2]。WRKY廣泛參與植物種子萌發(fā)與休眠、開花、代謝、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，還參與抵御生物和非生物脅迫等反應(yīng)過程。擬南芥AtWRKY33基因直接調(diào)控了植物抗毒素Camalexin 的合成[3]，并且調(diào)控大量抗病相關(guān)基因的表達(dá)[4]。大豆中GmWRKY58和GmWRKY76的過表達(dá)會造成作物提早開花，表達(dá)量的區(qū)別對花形態(tài)造成不同影響[5]。水稻中OsWRKY6基因的過表達(dá)有助于提高作物對病原菌的抗性，同時可直接調(diào)控異分支酸合成酶的表達(dá)從而增加水楊酸的濃度實現(xiàn)自我調(diào)節(jié)[6]。小麥（Triticum aestivum）TaWRKY93可調(diào)節(jié)作物對滲透壓、高鹽、干旱和低溫等脅迫的耐性[7]。迄今為止，研究人員已經(jīng)在大麥[8]、擬南芥[9]、大豆[10]和水稻[11]等多種植物中都鑒定到不同數(shù)量的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。

病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS-induced gene silencing， VIGS）是引起內(nèi)源mRNA特異性降解、引起基因轉(zhuǎn)錄沉默的技術(shù)。VIGS試驗周期短，操作簡便，并且無需轉(zhuǎn)化。近年來，在植物基因功能研究中，VIGS技術(shù)作為一種簡單、快速、高效的反向遺傳學(xué)技術(shù)在禾本科植物基因功能研究中發(fā)揮了重要作用[12-13]。

本研究以前期工作獲得的TaWRKY基因為基礎(chǔ)[14]，利用VIGS技術(shù)獲得沉默植株，通過對基因沉默前后白粉菌侵染情況進(jìn)行觀察統(tǒng)計，最終確定TaWRKY基因在小麥抗白粉病過程中的功能。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

抗白粉病品種Brock，由Ray Johnson博士惠贈。

小麥白粉菌15號生理小種，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.2 沉默TaWRKY的VIGS載體構(gòu)建

在目的基因核苷酸序列的非保守區(qū)，設(shè)計上、下游特異性沉默引物TaWRKY-VIGS-F和TaWRKY-VIGS-R，以抗病小麥Brock總RNA合成的cDNA為模版，擴(kuò)增富集沉默片段，將該片段與BSMVγ：連接構(gòu)建重組載體BSMVγ：TaWRKY，構(gòu)建過程參見Li 等[15]。

1.3 基因沉默效率檢測

通過限制性內(nèi)切酶酶切線性化、體外轉(zhuǎn)錄后，獲得病毒RNA組分通過摩擦接種方法接種到小麥第2葉上，待接NH2O（對照1）、BSMV：GFP（對照2）和BSMV： TaWRKY組小麥第3葉伸展完全，采用抖拂法對各株植株第3葉均勻高密度接種新鮮白粉菌孢子，在相應(yīng)時間點取葉片，利用半定量PCR方法檢測這3組植株中TaWRKY基因的mRNA水平的水平變化，從而確定TaWRKY基因沉默的效率。

1.4 基因沉默后對小麥抗白粉病表型的影響

取接種48，72 h和7 d后的小麥葉片，用考馬斯亮藍(lán)染色方法染色并觀察統(tǒng)計白粉菌孢子的生長發(fā)育情況，通過與對照白粉菌孢子萌發(fā)、畸形胞比例等的對比分析，確定目標(biāo)基因在抗白粉病過程中的貢獻(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 VIGS沉默載體構(gòu)建

根據(jù)已獲得TaWRKY基因序列，在基因的非保守區(qū)設(shè)計添加了NheI識別序列的引物WRKY-V-F（AGCCGCAGCAGCAGAACG）、WRKY-V-R（CTTGAAGCTGGGGTCCCTC）。以含TaWRKY基因序列的重組質(zhì)粒作為模板，擴(kuò)增用于構(gòu)建BSMV重組載體的目的基因片段，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。目的片段大小約為250 bp左右，隨后將回收后的目的片段進(jìn)行酶切形成粘性末端，BSMV載體同樣經(jīng)過酶切回收，與目的片段進(jìn)行連接，通過進(jìn)一步篩選、驗證，挑選陽性克隆送測驗證。

2.2 VIGS技術(shù)沉默靶基因后TaWRKY表達(dá)水平檢測

在TaWRKY基因的特異性核苷酸序列區(qū)段設(shè)計引物，擴(kuò)增一個長227 bp的片段構(gòu)建TaWRKY基因沉默載體BSMVγ：TaWRKY。本次沉默試驗共設(shè)置4個組別，分別為H2O對照組（空白對照）、BSMV：GFP對照組（陽性對照）、BSMV：PDS對照組（沉默PDS基因）、BSMV： TaWRKY試驗組（沉默目的基因TaWRKY）。為了驗證本試驗所建立的沉默體系成功有效，分別對各組摩擦接種后約15 d的小麥第3葉進(jìn)行表型觀察，結(jié)果如圖2所示。除BSMV：PDS對照組葉片發(fā)生明顯白化現(xiàn)象之外，其他組葉片均呈綠色，說明該基因沉默體系構(gòu)建成功。

2.3 TaWRKY基因沉默效率驗證

為了進(jìn)一步證實TaWRKY基因是否被有效沉默，采用半定量PCR的方法，對沉默后各組植株中TaWRKY基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，摩擦接種后，TaWRKY試驗組的mRNA水平明顯低于H2O和GFP對照組，說明小麥內(nèi)源TaWRKY基因被有效沉默了。另外，在接種重組病毒BSMV：GFP后，TaWRKY基因的表達(dá)也有輕微下調(diào)，該現(xiàn)象可能是由于病毒的侵染對植株造成了影響。

2.4 TaWRKY基因沉默植株抗病分析

為了進(jìn)一步研究TaWRKY基因在小麥葉片與白粉菌的互作過程中所起到的調(diào)控作用，本研究使用考馬斯亮藍(lán)染色法分別對接種48，72 h和7 d后的GFP組、TaWRKY組小麥植株的第3葉進(jìn)行固定、染色、制片，在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，觀察各時間點中，白粉菌萌發(fā)形態(tài)及生長狀態(tài)，如圖4所示。從圖4中可以看出：染菌48 h后，TaWRKY組白粉菌孢子萌發(fā)狀態(tài)優(yōu)于對照組，孢子萌發(fā)，芽管伸長，形成附著胞；染菌72 h后，TaWRKY試驗組白粉菌孢子大量萌發(fā)形成次生菌絲，而各對照組中，孢子萌發(fā)出現(xiàn)分瓣型畸形附著胞、纖細(xì)型畸形附著胞等；染菌7 d后，TaWRKY試驗組白粉菌孢子大量生成串珠狀分生孢子，而各對照組中，僅有少量孢子萌發(fā)形成次生菌絲。

在鏡檢觀察孢子發(fā)育結(jié)構(gòu)的同時，統(tǒng)計各個視野內(nèi)白粉菌孢子萌發(fā)率、畸形率、寄主抗性等參數(shù)。統(tǒng)計結(jié)果如圖5、圖6所示。由圖可以得出，接種白粉菌48 h后，白粉菌對TaWRKY基因沉默后的植株侵染成功率增加，畸形附著胞比例下降，與GFP對照組相比，TaWRKY基因沉默組植株白粉菌孢子萌發(fā)率上升，畸形附著胞（分瓣型附著胞、纖細(xì)型附著胞等）比例下降。

3 結(jié)論與討論

自1994年，Ishiguro和Nakamura[16]首次母適恚Ipomoea batatas）中克隆出第一個WRKY蛋白SPF1，研究人員對于植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族開展了大量研究。越來越多的研究結(jié)果表明，WRKY 蛋白在植物生長發(fā)育，抵御生物以及非生物脅迫等多種生理生化過程中發(fā)揮重要作用[17]。前期工作中，筆者在小麥Brock中分離到一個WRKY類轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY，并初步證實該基因參與了小麥的白粉菌脅迫應(yīng)答反應(yīng)，但還不能夠較確切了解TaWRKY基因與小麥抗白粉病之間的關(guān)系[12]。

關(guān)于病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因功能研究[18-21]，但該方法由于涉及到病毒感染，從而影響對正確結(jié)果的判斷而備受爭議。本研究為了降低這種系統(tǒng)誤差，采取了3個對照組，即用GKP緩沖液作為摩擦接種介質(zhì)為陰性對照，用綠色熒光蛋白基因構(gòu)建γ載體BSMVγ：GFP、編碼葉綠素關(guān)鍵酶基因PDS基因構(gòu)建γ載體BSMVγ：PDS為兩個陽性對照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：GKP緩沖液和GFP對照組生長正常，沒有病毒侵染后留下的病斑，生長正常，說明病毒對葉片生長沒有明顯影響；PDS組出現(xiàn)了葉片白化現(xiàn)象，說明PDS基因被有效沉默，表明基因沉默系統(tǒng)可用；基因沉默后再接種白粉菌孢子7 d后，白粉菌孢子充分萌發(fā)。與GFP組相比，TaWRKY基因沉默組小麥葉片表面的白粉菌附著胞畸形率明顯下降，白粉菌的成功侵染率顯著上升。因此，推測TaWRKY基因可能在小麥抗白粉菌反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

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