一周學(xué)習(xí)計(jì)劃精選(九篇)
前言：一篇好文章的誕生，需要你不斷地搜集資料、整理思路，本站小編為你收集了豐富的一周學(xué)習(xí)計(jì)劃主題范文，僅供參考，歡迎閱讀并收藏。
第1篇：一周學(xué)習(xí)計(jì)劃范文
關(guān)鍵詞：益氣活血藥；毛細(xì)血管密度；周細(xì)胞計(jì)數(shù)；心肌梗死；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.07.015
中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2013）07-0038-05
Change of Capillary Pericapillary Cells in Rats with Myocardial Infarction and Effect of Supplementing Qi and Activating Blood Circulation Herbs HUANG Kun， YANG Dan-dan， GUO Shu-wen， SUN Qing， ZHANG Lu， QI Xin， WAN Ting， ZHENG Cheng-long （Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029 ， China）
Abstract：Objective To observe the change of capillary pericapillary cells in rats with myocardial infarction and the influence of supplementing qi and activating blood circulation herbs， and explore its mechanism of improving myocardial perfusion. Methods The rat model was established by ligaturing the left anterior descending coronary artery. On the base of ECG evaluation， successfully modeled rats were randomly divided into the model group， group treated with supplementing qi and activating blood circulation Chinese medicine （activating blood and supplementing qi group）， group treated with Perindopril （Perindopril group）， group treated with Tongxinluo Capsules （Tongxinluo group）. The sham-operation group was taken as the control. There were totally 5 groups. The model group and the sham-operation group were treated with normal saline. The changes of myocardial capillary density （MCD） and number of pericapillary cells on the 7th， 28th day after medicinal administration were observed. Results On the 7th and 28th day， the MCD decreased significantly and the number of capillary pericapillary cells increased significantly in the model group compared with the sham-operation group （P
Key words：supplementing qi and activating blood circulation herbs；myocardial capillary density；number of pericapillary cells；myocardial infarction；rats
研究顯示，心肌梗死患者雖然經(jīng)過(guò)搭橋或支架置入術(shù)后使梗死相關(guān)冠脈再通，或經(jīng)冠脈造影證實(shí)已達(dá)TMI3級(jí)血流的梗
基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81173142）
通訊作者：郭書文，E-mail：
死相關(guān)血管，有超過(guò)25%的患者心肌組織水平的血流灌注并未恢復(fù)[1]。因此，減少缺血心肌再灌注損傷、保持心肌微血管的完整性、改善缺血心肌血供狀態(tài)、恢復(fù)心肌細(xì)胞功能，是目前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。
前期的系列研究結(jié)果顯示，益氣活血方能明顯促進(jìn)大鼠缺血心肌微血管生成而改善心肌缺血，并能抑制心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子有顯著調(diào)節(jié)作用[2-4]。本研究采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的方法建立大鼠急性心肌梗死后心衰模型，利用免疫組織化學(xué)方法觀察模型大鼠心肌毛細(xì)血管周細(xì)胞的變化，以及益氣活血中藥對(duì)其的影響，進(jìn)一步探討益氣活血中藥改善心肌血流灌注的作用機(jī)制。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 動(dòng)物
健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，清潔級(jí)，8周齡，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。
1.2 藥物
益氣活血藥由黃芪、人參、當(dāng)歸、川芎、三七粉等組成。根據(jù)前期研究結(jié)果[5-6]選擇益氣活血藥（2∶1）的劑量組合[5-6]。依口服劑工藝制備，按處方比例稱取中藥材，加9倍量水，煎煮2次，每次2.5 h，共5 h，水煎液過(guò)濾，濃縮，加乙醇調(diào)含醇量至50%，過(guò)濾，回收乙醇，過(guò)濾，調(diào)整濃度為相當(dāng)原藥材2 g/mL，北京中醫(yī)藥大學(xué)藥廠提供。
對(duì)照藥物選用通心絡(luò)膠囊，石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)110723-120116；培哚普利片，施維雅（天津）制藥有限公司，批號(hào)P2009971052951。
1.3 試劑與儀器
BA3414 兔抗鼠CD34抗體（武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品），BM0002小鼠抗α-SMA抗體（武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品），血清內(nèi)皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO），南京建成生物工程公司提供。RSP1002型小動(dòng)物呼吸機(jī)（Kent Scientific Corporation）。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 造模
采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎方法[7]。用1%戊巴比妥鈉腹腔注射（40 mg/kg）麻醉后，背位固定，行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，在左側(cè)第3、4肋間切開皮膚，鈍性分離肌層，打開胸腔，用開胸器推開胸腺擴(kuò)大手術(shù)視野，充分暴露心臟，用帶線縫合針在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間于左心耳下約2 mm處，無(wú)張力的狀態(tài)下將左前降支連同少量的心肌組織一起結(jié)扎，然后迅速將心臟復(fù)位，關(guān)閉胸腔。全部手術(shù)過(guò)程在30 min內(nèi)完成，嚴(yán)格無(wú)菌操作。術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素預(yù)防感染。以結(jié)扎部位以下心肌變灰白、搏動(dòng)減弱、心電圖肢體導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段弓背向上明顯抬高為造模成功的標(biāo)志。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程相同，僅繞過(guò)左冠狀動(dòng)脈，打松結(jié)。
2.2 分組與給藥
將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、中藥組、培哚普利組、通心絡(luò)組。
各組于造模的第1日開始分別灌胃相應(yīng)藥物，每日1次。通心絡(luò)組每日給予通心絡(luò)膠囊30 mg/kg體質(zhì)量，培哚普利組每日給予培哚普利片0.72 mg/kg體質(zhì)量，益氣活血組每日給予益氣活血中藥21 g/kg體質(zhì)量[5-6]。各干預(yù)藥物均溶于無(wú)菌蒸餾水中，在保證藥物劑量的前提下，調(diào)整濃度使每只動(dòng)物給藥容積均為10 mL/（kg?d）。假手術(shù)組和模型組每日以相同容積無(wú)菌蒸餾水灌胃。連續(xù)灌胃28 d。
2.3 標(biāo)本采集
稱取大鼠體質(zhì)量，用1%戊巴比妥鈉麻醉，剪開腹腔，從腹主動(dòng)脈取血，分離出血清待測(cè)。然后剪斷肋骨和胸肌，暴露胸腔取出心臟，用生理鹽水洗去血污，剔除血管、脂肪等非心肌組織，從左心室最大橫徑處切開，將切好的下半部分心臟放入預(yù)先準(zhǔn)備的4%多聚甲醛液中固定備用，進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)方法處理，制作石蠟切片。據(jù)各組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的成活數(shù)量分別觀察第7、28日2個(gè)時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)的變化情況。
2.4 心肌病理形態(tài)學(xué)觀察
將心肌組織用不同濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋、切片，脫臘，二甲苯透明，HE常規(guī)染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封固，光學(xué)顯微鏡觀察。
2.5 心肌毛細(xì)血管密度
石蠟切片脫蠟至水；3%過(guò)氧化氫室溫孵育8 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗3次（每次2 min），電爐加熱沸騰后斷電，間隔7 min，反復(fù)2次，冷卻后PBS（pH 7.2～7.6）洗滌2次，滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，滴加CD34一抗（濃度為1∶100），4 ℃過(guò)夜，第2日早晨滴加生物素山羊抗小鼠IgG，室溫20 min，PBS洗3次（每次2 min），滴加SABC，室溫20 min，PBS洗4次（每次5 min），DAB顯色，取1 mL蒸餾水，A、B、C試劑各加1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制時(shí)間，蒸餾水沖洗，蘇木素輕度復(fù)染，1～2 s即可，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。
2.6 免疫組化染色法檢測(cè)周細(xì)胞
石蠟包埋，切片（厚度4 ?m，每只鼠各取3張切片），脫蠟，高溫高壓抗原修復(fù)，噴氣后計(jì)時(shí)2 min，自然冷卻，水洗。4 ℃下于1∶300 α-SMA單克隆抗體孵育24 h，每張切片滴加50 ?L EnVisionTM試劑，室溫下孵育30 min。滴加新鮮配制的顯色劑（DAB），蘇木素復(fù)染。顯微鏡下觀察，胞漿顯棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞。按下法計(jì)數(shù)：先在100×視野下隨機(jī)選擇血管密度高的5個(gè)區(qū)和血管密度低的5個(gè)區(qū)作為計(jì)數(shù)部位，后在400×視野下計(jì)數(shù)微血管旁胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒的周細(xì)胞數(shù)，每只大鼠計(jì)數(shù)20個(gè)視野，最后以平均每個(gè)視野（400×）的周細(xì)胞數(shù)表示。小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞亦為α-SMA陽(yáng)性表達(dá)，根據(jù)血管壁厚度及結(jié)構(gòu)可與周細(xì)胞相區(qū)別，此類陽(yáng)性細(xì)胞不在計(jì)數(shù)范圍內(nèi)。
2.7 血清內(nèi)皮素-1、一氧化氮測(cè)定
采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定各組大鼠血清ET-1、NO的變化，具體方法嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作。根據(jù)各組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的成活數(shù)量分別觀察第7、28日2個(gè)時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)的變化情況。
3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。一般資料采用描述性分析，計(jì)量資料以―x±s表示，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)及百分?jǐn)?shù)描述；多個(gè)樣本計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料符合正態(tài)性分布采用t檢驗(yàn)，如不符合正態(tài)性分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)，比較各項(xiàng)指標(biāo)在治療前后之間的差異，多組間差異性統(tǒng)計(jì)采用方差分析，若方差不齊，則用Games-Howell分析，雙側(cè)檢驗(yàn)。P
4 結(jié)果
4.1 模型建立情況
采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法致大鼠急性心肌梗死后，肢導(dǎo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段呈弓背向上抬高，缺血心肌很快變蒼白色。共手術(shù)100只，造模成功81只，死亡19只，其中手術(shù)中死亡8只，急性心肌梗死造模成功后24 h內(nèi)死亡3只，給予藥物治療后死亡3只，注射麻藥后行心臟超聲檢查后死亡5只，死亡原因?yàn)楹粑Ｖ?、室顫和大出血，造模成功?1.0%。第7日觀察大鼠42只，第28日觀察大鼠39只。
4.2 各組大鼠心肌形態(tài)學(xué)觀察
第7日：假手術(shù)組大鼠心外膜未見纖維素滲出及未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組心肌梗死區(qū)炎癥反應(yīng)明顯，有泡沫狀組織細(xì)胞聚集，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維斷裂、排列紊亂，壞死的心肌組織由新生的肉芽組織取代；梗死區(qū)邊緣有充血、出血及炎細(xì)胞帶，心外膜有炎性及纖維素性滲出物。培哚普利組病理改變與模型組相似，但病變范圍較模型組明顯減小。通心絡(luò)組病理改變與模型組相似，但病變范圍較模型組明顯減小，較培哚普利組病變范圍小。益氣活血組病理改變與模型組相似，但病變范圍較模型組明顯減小，較培哚普利組及通心絡(luò)組病變范圍較小。見圖1。
第28日：假手術(shù)組大鼠心外膜未見纖維素滲出及未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠心肌梗死區(qū)由纖維母細(xì)胞、纖維細(xì)胞及致密的膠原纖維束組成，呈束狀或平行排列，膠原纖維束之間有極少殘存的心肌組織，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，地圖狀瘢痕組織形成；心室腔擴(kuò)大，室壁變薄。培哚普利組大鼠病理改變與模型組相似，但病變范圍較模型組明顯減小，且梗死區(qū)有島狀或細(xì)帶狀的心肌組織。通心絡(luò)組大鼠病理改變與模型組相似，但病變范圍較模型組明顯減小，且梗死區(qū)有島狀或細(xì)帶狀的心肌組織，但較培哚普利組病變范圍大。益氣活血組大鼠病理改變與模型組相似，但病變范圍較模型組明顯減小，且梗死區(qū)有島狀或細(xì)帶狀的心肌組織，但較培哚普利組病變范圍大。見圖2。
假手術(shù)組 模型組
益氣活血組 培哚普利組 通心絡(luò)組
圖1 第7日HE染色大鼠心肌病理形態(tài)（×50）
假手術(shù)組 模型組
益氣活血組 培哚普利組 通心絡(luò)組
圖2 第28日HE染色大鼠心肌病理形態(tài)（×100）
4.3 益氣活血中藥對(duì)心肌梗死大鼠血清內(nèi)皮素-1、一氧化氮水平的影響
與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清ET-1含量明顯升高，NO水平下降（P
表1 各組大鼠血清ET-1、NO水平比較（―x±s，pg/mL）
組別 術(shù)后第7日 術(shù)后第28日
只數(shù) ET1 NO 只數(shù) ET1 NO
假手術(shù)組 10 5.37±1.06 31.12±2.57 9 6.38±1.73 30.38±4.00
模型組 7 13.67±1.68## 19.41±3.24## 7 14.60±2.38## 16.23±3.05##
益氣活血組 9 8.06±1.21** 41.71±4.43** 8 8.97±1.07** 40.11±5.51**
培哚普利組 8 10.65±1.12** 33.02±2.68** 8 7.30±1.37** 45.26±6.60**
通心絡(luò)組 8 9.87±0.73** 37.76±3.34** 7 9.57±1.57** 35.06±5.20**
注：與假手術(shù)組比較，##P
4.4 益氣活血中藥對(duì)心肌梗死大鼠毛細(xì)血管密度的影響
在病理圖像分析系統(tǒng)下測(cè)定各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)平均毛細(xì)血管密度（MCD）。第7日：模型組較假手術(shù)組心肌梗死邊緣區(qū)MCD明顯降低（P
表2 各組大鼠心肌MCD比較（―x±s）
組別 n 第7日 第28日
假手術(shù)組 20 612.79±33.35 611.11±25.67
模型組 20 533.67±20.27## 493.27±19.38##
益氣活血組 20 1178.50±33.27** 1051.30±30.12**
培哚普利組 20 1010.10±33.27** 1099.30±33.98**
通心絡(luò)組 20 1094.30±33.12** 974.75±35.41**
4.5 益氣活血中藥對(duì)心肌梗死大鼠毛細(xì)血管周細(xì)胞計(jì)數(shù)影響
第7日：模型組較假手術(shù)組心肌梗死邊緣區(qū)周細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加，益氣活血中藥組、培哚普利組、通心絡(luò)組與模型組比較，梗死邊緣區(qū)的周細(xì)胞計(jì)數(shù)減少（P
表3 各組大鼠心肌周細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（―x±s，個(gè)）
組別 n 第7日 第28日
假手術(shù)組 20 0.8±0.84 1.2±0.84
模型組 20 8.2±1.30## 14.0±1.58##
益氣活血組 20 4.2±0.84* 4.4±1.14**
培哚普利組 20 5.8±0.84** 3.6±1.14**
通心絡(luò)組 20 4.4±0.55** 5.8±1.30**
注：與益氣活血組比較，P
P
5 討論
臨床研究表明，急性心肌梗死患者多存在“氣虛血瘀”的中醫(yī)病理[8]。實(shí)驗(yàn)的中藥組方中，生曬參、黃芪大補(bǔ)元?dú)?、廣益五臟，針對(duì)氣虛的主要病機(jī)；三七、川芎、當(dāng)歸為臣，活血通絡(luò)、止血消瘀。諸藥相合，氣行則血行，血行則氣實(shí)，諸藥合用，標(biāo)本兼治，相得益彰，共奏益氣活血、化瘀通絡(luò)之功效。
冠脈微血管結(jié)構(gòu)完整性與功能正常，是確保心肌收縮力儲(chǔ)備和局部功能恢復(fù)的先決條件，是心肌存活的必備條件，當(dāng)發(fā)生微小動(dòng)脈和阻力血管的功能及結(jié)構(gòu)變化時(shí)，冠脈血流速率和血流儲(chǔ)備的變化可引起心肌缺血。低灌注梗死區(qū)和正常心肌之間的慢復(fù)流區(qū)域毛細(xì)血管內(nèi)皮腫脹、突出甚至脫落，受周邊的壞死組織壓迫，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)完整性受損，心肌毛細(xì)血管周細(xì)胞功能失調(diào)。血管壁在結(jié)構(gòu)上由血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管周圍細(xì)胞組成，它們分別構(gòu)成血管的內(nèi)外壁。周細(xì)胞又叫壁細(xì)胞，可以分化為巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，具有收縮能力，從而調(diào)節(jié)微循環(huán)的灌流量和通透性[9-10]。
有研究顯示，早期心肌缺血缺氧性壞死中周細(xì)胞數(shù)量在4 h后明顯增多，12 h后開始下降，48 h后顯著低于正常水平，推測(cè)周細(xì)胞作為心肌中的間質(zhì)細(xì)胞可能是心肌纖維化發(fā)生發(fā)展中的主要效應(yīng)細(xì)胞[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用益氣活血中藥后，毛細(xì)血管周細(xì)胞的計(jì)數(shù)減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益氣活血組較模型組心肌梗死邊緣區(qū)域MCD明顯增加，可見周細(xì)胞對(duì)毛細(xì)血管生長(zhǎng)起到調(diào)控的作用。研究發(fā)現(xiàn)新生血管的生長(zhǎng)和維持主要由周細(xì)胞的募集和分化所推動(dòng)[12-13]。周細(xì)胞募集并伴隨發(fā)生基底膜重塑[14-15]?？梢?，周細(xì)胞的募集對(duì)血管新生是必不可少的。
此外，益氣活血中藥可提升內(nèi)皮分泌NO水平，并相應(yīng)降低ET-1水平。NO和ET-1是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一對(duì)作用相反的血管活性分子，NO的含量與生物活性的變化能夠反映內(nèi)皮功能的狀態(tài)。與益氣活血組模型組比較，ET-1下降，NO升高，說(shuō)明益氣活血中藥具有保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用。
總之，益氣活血中藥可以通過(guò)降低心肌梗死大鼠毛細(xì)血管周細(xì)胞計(jì)數(shù)，維持血管的相對(duì)完整性，改善局部微循環(huán)的血流，減少梗死面積，并促進(jìn)血管新生，調(diào)節(jié)NO/ET-1的平衡，從而達(dá)到改善局部心肌血供的目的。
參考文獻(xiàn)：
[1] Skyschally A， Leineweber K， Gres P， et al. Cornary micro enbolization[J]. Basic Res Cardiol，2006，101（5）：373-382.
[2] 黃培培，郭書文，楊蟠儲(chǔ)，等.心肌缺血大鼠血清TNF-α、IL-6變化及益氣活血藥對(duì)其的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（9）：614-617.
[3] 張九峰.益氣活血藥對(duì)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡及其調(diào)控分子的影響[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2011.
[4] 周劍宇.益氣活血藥防治大鼠心力衰竭心臟重塑的調(diào)節(jié)機(jī)制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2011.
[5] 郭書文，崔巍，王碩仁，等.血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡與增殖的時(shí)相特征及益氣活血藥對(duì)其影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（11）：1004-1007.
[6] 郭書文，王國(guó)華.益氣活血藥配合西醫(yī)治療冠心病心絞痛臨床研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2009，16（9）：12-13.
[7] 劉開宇，田海，孫露，等.標(biāo)準(zhǔn)化大鼠心肌梗死模型的制作[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，41（6）：531-534.
[8] 易慧智，吳偉康，侯燦.中藥防治心肌缺血再灌注損傷的進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志，1995，15（8）：509-511.
[9] Kurz H， Fehr J， Nitschke R， Burkhardt H. Pericytes in the mature chorioallantoicmembrane capillary plexus contain desmin and alpha- smooth muscle actin：relevance for non-sprouting angiogenesis[J]. Histochemistry and Cell Biology，2008，130（5）：1027-1040.
[10] Oishi K， Kamiyashiki T， Ito Y. Isometric contraction of microvascular pericytes from mouse brain parenchyma[J]. Microvascular research，2007，73（1）：20-28.
[11] 李永梅，任立群，王心蕊.早期心肌缺血缺氧性壞死中周細(xì)胞數(shù)量的變化[J].心臟雜志，2009，21（2），211-214.
[12] Paquet-Fifield S， Schluter H， Li A， et al. A role for pericytes as micro environmental regulators of human skin tissue regeneration[J]. The Journal of clinical investigation，2009， 119（9）：2795-2806.
[13] Lin SL， Kisseleva T， Brenner DA， et al. Pericytes and perivascular fibroblasts are the primary source of collagen producing cells in obstructive fibrosis of the kidney[J]. The American Journal of Pathology，2008，173（6）：1617-1627.
[14] Greenberg JI， Shields DJ， Barillas SG， et al. A role for VEGF as a negative regulator of pericyte function and vessel maturation[J]. Nature，2008，456（7223）：809-813.
第2篇：一周學(xué)習(xí)計(jì)劃范文
【摘要】 目的對(duì)亞洲帶絳蟲膜聯(lián)蛋白B2(Annexins B2)進(jìn)行克隆表達(dá)及免疫學(xué)初步研究。方法利用在線生物信息學(xué)工具從亞洲帶絳蟲成蟲cDNA文庫(kù)中篩選出Annexins B2基因，并將該基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸埃希菌BL21/DE3中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定，重組后的蛋白用His-鎳蛋白純化柱純化，純化的重組蛋白用Western blotting進(jìn)行免疫學(xué)分析。結(jié)果PCR、雙酶切及重組質(zhì)粒DNA測(cè)序均顯示重組體構(gòu)建成功，并得到高純度的蛋白，且該重組蛋白可被亞洲帶絳蟲、豬帶絳蟲及牛帶絳蟲患者的血清識(shí)別。結(jié)論亞洲帶絳蟲成蟲Annexins B2基因可在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得具有免疫活性的高效表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】 亞洲帶絳蟲;膜聯(lián)蛋白B2;基因克隆;免疫反應(yīng)性
ABSTRACT: ObjectiveTo clone and express the gene named as Annexins B2 of Taenia saginata asitica so as to analyze the immunogenicity of its recombinant protein.MethodsBy online analysis of the gene at bioinfomatics websites to identify the gene from the Taenia saginata asiatica full-length cDNA plasmid library， the gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+) and then transformed to E.coli BL21 with IPTG induction. Thereafter， the gene product was analyzed by SDS-PAGE and purified by Ni-NTA affinity chromatography. In addition， the immunoreactivity of the purified recombinant proteins was analyzed by Western blotting.ResultsAs demonstrated by PCR， double enzyme digestion and DNA sequencing indicated that the recombinant plasmid was successfully constructed and highly expressed. The recombinant protein tested with Western blotting analysis could react with Taenia asiatica and Taeniarhynchus saginatus infected patient serum.ConclusionThe Annexins B2 of Taenia saginata asitica has been cloned and expressed in the prokaryotic expression system and the purified protein has been confirmed with immunogenicity.
KEY WORDS: Taenia saginata asiatica; Annexins B2; gene cloning; immunoreactivity
鑒于亞洲帶絳蟲與豬帶絳蟲及牛帶絳蟲在起源、分類學(xué)地位存在的差異[1-2]，本課題組率先構(gòu)建亞洲帶絳蟲成蟲全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)，并對(duì)該蟲進(jìn)行功能基因組的研究工作[3]。本文利用生物信息學(xué)工具從文庫(kù)中篩選到了一個(gè)膜聯(lián)蛋白B2(Annexins B2)的同源基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并對(duì)其原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫學(xué)方面的初步研究。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1血清、載體與菌株3種人體帶絳蟲患者血清取自糞檢陽(yáng)性的帶絳蟲患者。原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)及大腸埃希菌BL-21/DE3由中山大學(xué)熱帶病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。
1.1.2主要試劑和工具酶Ex Taq酶(含dNTP)，BamHⅠ，XhoⅠ，T4 DNA連接酶 (大連寶生物工程公司);異丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美國(guó)Promega公司);質(zhì)粒純化試劑盒(廣州東盛科技公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬IgG二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);氯化鈣、氯化鈉等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>
1.2方法
1.2.1Annexins B2基因的識(shí)別及擴(kuò)增將獲得的亞洲帶絳蟲Annexins B2基因進(jìn)行BLASTX分析。并根據(jù)已獲得的該基因全長(zhǎng)編碼序列的開放閱讀框，利用軟件設(shè)計(jì)引物(引物由上海聯(lián)合基因公司合成)，分別帶上BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)進(jìn)行PCR反應(yīng)。
1.2.2重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收、連接后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL-21/DE3感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性克隆依次進(jìn)行質(zhì)粒的提取、雙酶切和PCR鑒定，并進(jìn)行重組質(zhì)粒DNA測(cè)序鑒定(測(cè)序由英俊科技股份有限公司完成)。
1.2.3重組蛋白的表達(dá)及純化按照常規(guī)方法進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，考馬斯亮蘭蛋白染色液染色觀察蛋白表達(dá)情況。確定蛋白表達(dá)后，進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)，并判斷重組蛋白的可溶性，再將樣品加入預(yù)先處理好的Ni-IDA His.Bind樹脂親和層析純化柱中，最后再用PBS 24h透析以去掉過(guò)柱時(shí)留下的咪唑。
1.2.4Western blotting分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性用3種人體帶絳蟲患者及正常人血清與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗人IgG進(jìn)行Western blotting鑒定。
2結(jié)果
2.1Annexins B2基因的識(shí)別和序列分析該基因全長(zhǎng)922bp，編碼區(qū)為224～686bp。其最大ORF為其完整編碼區(qū)。
2.2原核重組質(zhì)粒的鑒定將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，產(chǎn)物行0.8g/L瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示在500bp左右有一清晰條帶，與目的基因大小基本相符。此外，重組質(zhì)粒的測(cè)序報(bào)告表明插入序列與理論序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。
2.2蛋白表達(dá)及純化結(jié)果將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL/DE3中，超聲裂解后SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示在大約25ku處出現(xiàn)高效表達(dá)條帶(圖2)，與目的蛋白基本相符。測(cè)得純化產(chǎn)物的蛋白濃度為0.526g/L。
2.3Western blotting鑒定純化蛋白的免疫反應(yīng)性
用感染亞洲帶絳蟲、豬帶絳蟲、感染牛帶絳蟲的患者血清以及亞洲帶絳蟲感染豬的血清與純化蛋白反應(yīng)的結(jié)果均顯示出較清晰的條帶，而陰性對(duì)照血清在相應(yīng)位置未識(shí)別出該蛋白條帶(圖3)，表明該表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫反應(yīng)性。圖1重組質(zhì)粒的PCR和雙酶切鑒定
Fig.1 The identification of the pET-28a(+)-Ta Annexins B2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1：DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL2000);1：PCR產(chǎn)物;2：pET-28a(+)質(zhì)粒雙酶切;3：pET-28a(+)-Annexins B2重組質(zhì)粒雙酶切;M2：DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL 15000)。圖2100g/L SDS-PAGE分析pET-28a(+)-Ta Annexins B2在大腸埃希菌中的表達(dá)產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物Fig.2 100g/L SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product
M：蛋白Marker;1：pET-28a(+)IPTG未誘導(dǎo);2：pET-28a(+)IPTG誘導(dǎo);3：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG未誘導(dǎo);4：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG誘導(dǎo);5：pET-28a(+)-Annexins B2上清;6：pET-28a(+)-Annexins B2沉淀;7：pET-28a(+)-Annexins B2純化蛋白。
3討論
帶絳蟲病的流行在我國(guó)西部一直是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。每年由帶絳蟲病造成的健康和畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失上百億，嚴(yán)重影響西部欠發(fā)達(dá)地區(qū)的社會(huì)發(fā)展。目前，亞洲帶絳蟲病的防治研究的重點(diǎn)集中在診斷和疫苗候選抗原、藥物靶標(biāo)、致病的分子機(jī)制研究。圖3重組蛋白的Western blotting 鑒定Fig.3 Western blotting analysis of the recombinantsM：蛋白Marker;1：純化蛋白與亞洲帶絳蟲患者血清的反應(yīng)結(jié)果;2：純化蛋白與牛帶絳蟲患者血清的反應(yīng)結(jié)果;3：純化蛋白與豬帶患者血清的反應(yīng)結(jié)果;4：純化蛋白與亞洲帶絳蟲感染豬血清的反應(yīng)結(jié)果;5：純化蛋白與正常人血清的反應(yīng)結(jié)果。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)方法從已經(jīng)構(gòu)建好的亞洲帶絳蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中篩選出了一個(gè)膜聯(lián)蛋白(Annexins B2)的同源基因，并且預(yù)測(cè)出該基因位于胞漿，無(wú)跨膜區(qū)，二級(jí)結(jié)構(gòu)基本上是以α螺旋為主。這些都符合膜聯(lián)蛋白家族的共同特征[4]。根據(jù)膜聯(lián)蛋白家族分布廣泛，表達(dá)豐富且穩(wěn)定的特性，可以推測(cè)其在絳蟲的生理活動(dòng)中可能起著重要的作用。
膜聯(lián)蛋白是一個(gè)廣泛存在的蛋白家族，在所有真核基因組中廣泛表達(dá)。具有內(nèi)部重復(fù)單位和“G-X-G-T-(38residues)-D/E”基序[5]，即Ca2+結(jié)合區(qū)域的特征，用以結(jié)合帶有負(fù)電的脂質(zhì)。雖然它為鈣結(jié)合蛋白，但是在結(jié)構(gòu)上卻沒有EF手，而且在和Ca2+結(jié)合后，還可以與磷脂再次結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。例如，細(xì)胞的胞吞胞吐，離子通道的形成，調(diào)節(jié)磷脂酶A2的活性及細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度、抗炎癥反應(yīng)等。在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過(guò)程中，膜聯(lián)蛋白家族各成員在生物學(xué)特性和生理功能方面表現(xiàn)出非常復(fù)雜的關(guān)系，且在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，annexins沒有信號(hào)肽，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，是一個(gè)典型的細(xì)胞內(nèi)蛋白。但是，卻有學(xué)者發(fā)現(xiàn)它可以與細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制腫瘤[8]等。最新的研究報(bào)道，當(dāng)將其作為疫苗的候選因子時(shí)，可以消除一些寄生于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的寄生蟲。此外，學(xué)者們認(rèn)為膜聯(lián)蛋白是維持細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的重要蛋白。并可能具有激活纖維蛋白酶原的功能，有助于破壞宿主的結(jié)締組織，使蟲體抗原更加容易進(jìn)入宿主機(jī)體，誘發(fā)免疫應(yīng)答。因此，對(duì)該基因的研究有助于進(jìn)一步了解它的生物學(xué)功能及開辟預(yù)防治療寄生蟲病的新途徑[9-10]。
目前，Annexins B2已經(jīng)在豬囊尾蚴的研究被發(fā)現(xiàn)并命名，但是具體的生理功能還不清楚，且在亞洲帶絳蟲研究領(lǐng)域還是空白。因此，本研究將亞洲帶絳蟲成蟲annexins克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸埃希菌BL-21/DE3中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE結(jié)果表明，該蛋白在全菌和沉淀中都有表達(dá)，上清中有微量的表達(dá)，說(shuō)明annexins主要表達(dá)在包涵體中。因此，進(jìn)一步溶解包涵體[11]，經(jīng)變性處理并親和層析純化后，得到了大量較純的重組蛋白。此外，還嘗試性的用上清過(guò)柱純化并用蔗糖進(jìn)行蛋白濃縮，也得到部分有活性的蛋白。Western blotting就是以抗體-抗原沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)的，可用于不同抗原的比較和定量。其檢測(cè)結(jié)果表明所獲得的重組蛋白與豬帶絳蟲、牛帶絳蟲及亞洲帶絳蟲有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)且在絳蟲中的診斷特異性不高，推測(cè)其不能作為免疫診斷抗原的合適候選分子。但是，其具有免疫活性的高效表達(dá)。由此可推測(cè)它是一個(gè)具有開發(fā)潛力的基因。總之，本項(xiàng)研究填補(bǔ)了該蛋白在亞洲帶絳蟲研究領(lǐng)域的空白，也為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能及在診斷尤其是疫苗研究方面奠定了基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
\[1\]包懷恩. 我國(guó)亞洲帶絳蟲研究的現(xiàn)狀和展望 \[J\]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志， 2002， 2(3):215-219.
\[2\]張朝云，楊明，張科，等. 云貴州三地牛帶絳蟲核糖體tRNA-ITS1序列分析 \[J\].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2006， 31(4):291-295.
\[3\]黃江，胡旭初，包懷恩，等. 亞洲帶絳蟲成蟲全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)的構(gòu)建及EST測(cè)序 \[J\]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志， 2007， 7(2):116-118.
\[4\]MOSS SE， MORGAN RO. The annexins \[J\]. Genome Biol， 2004， 5:219-221.
\[5\]CHOI SH， KWON SR， LEE EH， et al. Molecular cloning， functional characterization and localization of an annexin from a fish gill fluke microcotyle sebastis (Platyhelminthes: Monogenea) \[J\]. Mol & Bioche Parasitol， 2009，163(1):48-53.
\[6\]高奮堂，曹云山，徐義先，等. 氟伐他汀對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A1表達(dá)水平的影響 \[J\]. 臨床心血管病雜志， 2006， 22(4):209-211.
\[7\]王義會(huì)，閆強(qiáng)，王平，等. 膜聯(lián)蛋白B2基因的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建 \[J\]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2007， 28(3):31-33.
\[8\]朱逢佳，曾蘇，曹江. 膜聯(lián)蛋白-1與腫瘤\[J\]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志， 2008， 30(5):581-585.
\[9\]ZHANG Y， WANG KH， GUO YJ， et al. Annexin B1 from Taenia solium metacestodes is a newly characterized member of the annexin family \[J\]. Biol Chem， 2007， 388(6):601-610.
第3篇：一周學(xué)習(xí)計(jì)劃范文
關(guān)鍵詞：慢性乙型肝炎；外周血；T淋巴細(xì)胞；共刺激分子；表達(dá)變化
慢性乙型肝炎源于機(jī)體細(xì)胞免疫功能紊亂，不能有效清除體內(nèi)病毒，其中T淋巴細(xì)胞在主導(dǎo)機(jī)體免疫功能方面發(fā)揮著重要的作用[1]。筆者主要探討慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)變化及臨床意義，將結(jié)果報(bào)告如下：
1 資料與方法
1.1一般資料 本次選取的40例研究對(duì)象均為南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院于2013年4月～2015年1月收治的慢性乙型肝炎患者作為觀察組，所有患者均知情同意，其中男29例，女11例，年齡37～68歲，平均年齡（45.3±5.6）歲；職業(yè)：教師16例、農(nóng)民工4例、企業(yè)高管8例、退休在家12例。所有患者經(jīng)檢查，均符合慢性乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除神經(jīng)系統(tǒng)障礙、嚴(yán)重心腦血管疾病、全身免疫系統(tǒng)疾病、凝血及造血功能障礙、甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎等患者。同時(shí)選取健康患者39例作為對(duì)照組，其中男30例，女9例，年齡36～69歲，平均年齡（45.8±5.7）歲；職業(yè)：教師15例、農(nóng)民工5例、企業(yè)高管9例、退休在家11例。兩組患者在性別、年齡等資料方面無(wú)顯著差異（P>0.05），具有可比性。
1.2方法
1.2.1試劑 在測(cè)定過(guò)程中，需要用到的試劑：鼠抗人CD3-APC、CD8-FIT、CTLA-4-PE、PD-1-PE熒光素標(biāo)記單克隆抗體，LgG-FITC、lgG-PE、lgG-APC同型對(duì)照融血?jiǎng)?，由美?guó)BD公司提供；另外需要乙型肝炎病毒及耐藥突變檢測(cè)試劑盒、HBV標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒、ALT檢測(cè)試劑盒。
1.2.2儀器 流式細(xì)胞儀、擴(kuò)增儀、高速冷凍離心機(jī)、全自動(dòng)生化分析儀、全自動(dòng)酶免分析儀、低溫冰箱。
1.2.3測(cè)定 外周血T淋巴細(xì)胞表面共刺激分子檢測(cè)具體方法：患者晨起空腹抽取外周靜脈血3 ml，抗凝混勻后分別置于5支不同的測(cè)定管中：其中第一管加入CD3、CD8、CD28，第二管中加入單抗CD3、CD8、CTLA-4，第三管中加入CD3、CD8、PD-1，第四管中加入單抗CD3、CD8、Tim-3，第五管中加入lgG-FTTC lgG-PE lgG-APC作為同型對(duì)照管，所有試管中均加入單抗20 μl，搖勻后在常溫下狀態(tài)下放置30 min，然后加入新鮮配置的溶血?jiǎng)u勻，在光線暗處放置15 min并離心5 min，使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行3次洗滌，并且每管中加入0.3 ml PBS，在4°C中放置后在1 d內(nèi)檢測(cè)。為了使結(jié)果更加精準(zhǔn)，輔助測(cè)定方法：并采用定時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)測(cè)定血清中HBV（乙型肝炎病毒）、DNA（脫氧核糖核酸）含量；采用雙抗體夾心時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測(cè)乙型肝炎病毒；采用全自動(dòng)生化分析儀監(jiān)測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶含量。
1.3觀察指標(biāo) 將觀察組分為為治療組、治療無(wú)效組、治療有效組，與對(duì)照組作比較。分析兩組患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)表達(dá)量[2]。分析兩組患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)表達(dá)量[3]。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SSPS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析，表示計(jì)量數(shù)據(jù)資料，采用t檢驗(yàn)，（%）表示計(jì)數(shù)資料，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P
2 結(jié)果
2.1患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)表達(dá)量分析 觀察組三組CD4*、CD8*T淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)表達(dá)量均明顯下降，低于對(duì)照組 （P
2.2患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)表達(dá)量分析 CD8*T淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。另外未治療組、治療無(wú)效組CD4*/CD8*比值明顯高于治療有效組、對(duì)照組（P
3 討論
與對(duì)照組相比較，觀察組CD4*、CD8*等表達(dá)量出現(xiàn)明顯下降，另外未治療組CD4*、PD-1*表達(dá)量明顯高于對(duì)照組、治療有效組、治療無(wú)效組。總體而言，觀察組CD4*T淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)表達(dá)量、絕對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組，但是CD8*T淋巴細(xì)胞亞群相對(duì)表達(dá)量升高，絕對(duì)表達(dá)量下降。研究表明，共刺激分子的絕對(duì)表達(dá)量更能反應(yīng)患者的免疫功能狀態(tài)[4]。
綜上所述，進(jìn)行共刺激分子表達(dá)變化研究可以為慢性乙型肝炎治療提供一定的依據(jù)，為深入評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能提供了新的研究角度。
參考文獻(xiàn)：
[1]宋華峰.負(fù)性共刺激分子BTLA/HVEM在慢性乙肝患者外周血T細(xì)胞上的表達(dá)特性及其臨床意義[D].江蘇：蘇州大學(xué)，2014.
[2]王琳.外周血T細(xì)胞免疫功能與乙肝慢性化的相關(guān)性研究[D].江蘇：蘇州大學(xué)，2014.
[3]曹麗娟.負(fù)性共刺激分子在慢性乙肝患者外周血Treg的表達(dá)特性及其臨床意義[D].江蘇：蘇州大學(xué)，2013.
第4篇：一周學(xué)習(xí)計(jì)劃范文
胞、Th1/Th2比值、IL17+Th17細(xì)胞的量及平均熒光強(qiáng)度、培養(yǎng)上清中IL17水平均低于治療前， 而與健康對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， 且聯(lián)合治療組降低的幅度均大于MTX治療組; 治療前后Th17細(xì)胞的量與C反應(yīng)蛋白(CRP)、 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAS28)的消長(zhǎng)呈正相關(guān)(P
【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎 類風(fēng)濕 流式細(xì)胞術(shù) 依那西普 Th亞群 Th17細(xì)胞
依那西普(etanercept)是II型腫瘤壞死因子(tumer necrosis factor， TNF)受體P75的細(xì)胞外部分和人IgG1的Fc段基因工程融合的蛋白二聚體(rhTNFR: Fc)， 可特異性阻斷TNFα與其細(xì)胞表面受體的相互作用， 實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗TNFα治療可明顯改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid
arthritis， RA)患者的病情［1］。TNFα除了在RA免疫發(fā)病及炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用外， 尚促進(jìn)IL2、 集落刺激因子(colonystimulating factor， CSF)和INFα等細(xì)胞因子的產(chǎn)生， 增加高親和力IL2受體的表達(dá)， 促進(jìn)T細(xì)胞增殖［2］， 推測(cè)抑制TNFα可能對(duì)T細(xì)胞及其亞群有下調(diào)作用。本研究中分離依那西普治療前后RA患者及健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells， PBMC)， 用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定Th1、 Th2及Th17細(xì)胞的表達(dá)和ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清中相應(yīng)的細(xì)胞因子水平并與患者病情進(jìn)行相關(guān)性分析， 旨在探討依那西普治療RA對(duì)Th細(xì)胞亞群的影響， 進(jìn)一步探討此療法的免疫機(jī)制。
1 材料和方法
1.1 材料
依那西普凍干粉針劑(etanercept， 商品名益賽普) 由上海中信國(guó)健藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。PerCP小鼠抗人CD4單克隆抗體(mAb)IgG1、FITC抗人IFNγmAb IgG1/PE抗人IL4 mAb IgG1及同型對(duì)照IgG1、Cytofix/ Cytoperm液及Perm/Wash液、流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD公
司。FITC抗人IL17mAb IgG1及同型對(duì)照IgG1購(gòu)自美國(guó)Ebioscience公司。淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津TBD生物技術(shù)發(fā)展中心。佛波酯(phorbol 12myristate13acetate， PMA)、 離子霉素(Ionomycin)、 莫能菌素(Monensin)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司， RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司?？谷薎L4 ELISA試劑盒、 抗人IFNγ ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司。抗人IL17 ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Ebioscience公司。
1.2 方法
1.2.1 RA患者的分組及處理方法
20例RA患者(男6例， 女14例， 年齡25～67歲， 平均42歲)， 為200611/200705在西京醫(yī)院門診或住院RA
患者， 均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)1987年RA分類標(biāo)準(zhǔn)， 病程為2～20年(平均9年)。20例患者均為活動(dòng)期中重度患者， 表現(xiàn)為6個(gè)或6個(gè)以上的關(guān)節(jié)腫脹; 6個(gè)或6個(gè)以上的關(guān)節(jié)觸痛; 并有以下3條標(biāo)準(zhǔn)中的任意2條: (1)晨僵持續(xù)時(shí)間≥45 min; (2)血沉≥28 mm/h; (3)C反應(yīng)蛋白(CRP)≥20 mg/dL?；颊呔逊梅€(wěn)定劑量的甲氨蝶呤(MTX， 每周7.5～15 mg)4周， 且未使用MTX以外其他病情緩解抗風(fēng)濕藥(DMARDs)。患者隨機(jī)分為2個(gè)治療組， 每組10例。聯(lián)合治療組， 給予MTX 7.5～15 mg口服， 每周1次， 同時(shí)給予皮下注射依那西普， 每次25 mg， 每周2次; MTX治療組， 為單用等量MTX治療; 療程均為12周。另設(shè)年齡、 性別匹配的健康獻(xiàn)血員10名作為正常對(duì)照。
1.2.2 RA患者病情活動(dòng)性及療效評(píng)價(jià)指標(biāo)
記錄晨僵時(shí)間， 采用目測(cè)模擬標(biāo)尺評(píng)價(jià)休息痛(VAS)， 計(jì)數(shù)壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、 腫脹關(guān)節(jié)數(shù)(包括雙手近端指間關(guān)節(jié)、 掌指關(guān)節(jié)、 腕關(guān)節(jié)、 肘關(guān)節(jié)、 肩關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)， 共28個(gè)關(guān)節(jié))， 記錄健康評(píng)估指數(shù)(HAQ)平均分， 魏氏法測(cè)ESR， 免疫比濁法測(cè)C反應(yīng)蛋白(CRP)， 并計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(DAS28)。
1.2.3 標(biāo)本采集及細(xì)胞分離
分別抽取治療前、治療12周后RA患者和健康對(duì)照組外周靜脈血5 mL， 采用肝素鈉抗凝， Ficol1密度梯度離心法分離PBMC， 調(diào)整PBMC密度為1×109/L， 懸浮于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中， 同步取1 mL細(xì)胞懸液， 進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色FCM測(cè)定Th細(xì)胞亞群; 取2 mL細(xì)胞懸液加入PMA(50 μg/L)、離子霉素(1 μmol/L)置于37℃孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜， 收集上清置于-70℃凍存待ELISA檢測(cè)。
1.2.4 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色FCM測(cè)定Th細(xì)胞亞群 取上述PBMC懸液(1×109/L)置于48孔培養(yǎng)板內(nèi)， 每孔1 mL， 并加PMA (50 μg/L)、離子霉素(1 μmol/L)和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑莫能菌素(2 μmol/L)以阻止細(xì)胞因子向細(xì)胞外分泌， 在37℃孵箱中培養(yǎng)5 h。收集細(xì)胞分為對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管， 分別加入PercP小鼠抗人CD4 mAb IgG1 10 μL， 混勻， 室溫放置20 min對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行染色。加入Cytofix/Cytoperm液200 μL， 4℃放置20 min， 通透和固定細(xì)胞并洗滌后， 進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色， 實(shí)驗(yàn)管分別加入IFNγ mAb IgG1/PE抗人IL4mAb IgG1或FITC抗人FITC抗人IL17 mAb IgG1各10 uL， 對(duì)照管加入同型對(duì)照抗體， 4℃避光孵育30 min后。用Perm/Wash液1 mL洗滌2次， 最后以300 μL洗滌液重懸細(xì)胞， 24 h內(nèi)采用FCM檢測(cè)分析。以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞(CD4+)， 最終以散點(diǎn)圖IFNγ、 IL4和IL17染色陽(yáng)性表示Th1細(xì)胞、 Th2細(xì)胞和Th17細(xì)胞， 用Cellsquest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。
1.2.5 ELISA檢測(cè)PBMC培養(yǎng)上清中IFNγ、 IL4、 IL17的水平
取上述凍存PBMC培養(yǎng)上清， 采用ELISA法檢測(cè)上清中IFNγ、IL4、IL17水平， 具體操作按試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔， 酶標(biāo)測(cè)試儀450 nm處讀數(shù)。
1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示， 采用SPSS11.0軟件分析， 各組間均數(shù)首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)， 如滿足方差齊性， 采用兩樣本t檢驗(yàn)， 如不滿足， 則采用秩轉(zhuǎn)換檢驗(yàn)方法， Th1、 Th17細(xì)胞陽(yáng)性率及Th1/Th2比值與病情活動(dòng)指標(biāo)的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析， 以P
2 結(jié)果
2.1 RA患者治療前后病情變化
兩組患者在治療12周后， DAS28較治療前降低或明顯降低(MTX治療組P
療組患者的休息痛、 晨僵時(shí)間亦有改善(P
2.2 外周血Th細(xì)胞亞群的比較
細(xì)胞膜表面標(biāo)志和胞內(nèi)細(xì)胞因子染色FCM測(cè)定顯示， 活動(dòng)期RA患者在治療前， 其外周血中CD4+IFNγ+Th1細(xì)
胞、 CD4+IL17+Th17細(xì)胞的數(shù)量以及Th1/Th2細(xì)胞比值均分別高于健康對(duì)照組［(27.0±2.9)% vs (23.2±1.7)%， P
2.3 PBMC培養(yǎng)上清中IFNγ、 IL4、 IL17的變化
ELISA法測(cè)得治療前活動(dòng)期RA患者PBMC培養(yǎng)上清中IFNγ、 IL4水平與健康對(duì)照相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， IL17水平明顯高于健康對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［(40±3.8) ng/L vs (30±2.0) ng/L， P
治療后IL17水平明顯低于治療前［(28±2.6) ng/L vs (40±3.8) ng/L， P
計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合治療組治療后的IL17水平下降幅度明顯大于MTX對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P
2.4 Th細(xì)胞亞群陽(yáng)性率與病情活動(dòng)指標(biāo)的相關(guān)性分析
對(duì)20例RA患者Th1、Th17細(xì)胞的量及Th1/Th2與CRP、 DAS28、 休息痛、 晨僵時(shí)間、HAQ平均分進(jìn)行相關(guān)性分析， 結(jié)果顯示RA患者Th17細(xì)胞的量與其CRP、 DAS28水平呈正相關(guān)(P
3 討論
依那西普治療RA的明顯作用已被大量實(shí)驗(yàn)證明［3］， 但其治療機(jī)制未明， 可能通過(guò)減少關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎細(xì)胞的浸潤(rùn)， 降低滑膜中細(xì)胞黏附因子的表達(dá)， 阻斷炎性因子的相互作用而減輕炎癥［4］。既往研究發(fā)現(xiàn)RA發(fā)生發(fā)展與Th1、Th2細(xì)胞數(shù)量和比例失衡密切相關(guān)， 鑒于Th1細(xì)胞在RA患
者炎性關(guān)節(jié)中的聚集， 曾認(rèn)為RA是以Th1細(xì)胞占主導(dǎo)地位的疾病， 而近年發(fā)現(xiàn)， RA滑膜存在產(chǎn)生細(xì)胞因子IL17的T細(xì)胞和滑液中高水平表達(dá)的IL17， 以及CIA動(dòng)物模型證實(shí)IL17促進(jìn)炎性細(xì)胞因子IL6、 TNFα的合成并參與RA的炎癥反應(yīng)和骨質(zhì)破壞， 提出以分泌IL17為主的
Th17細(xì)胞在RA發(fā)病中具有比Th1更重要的作用［5， 6］。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RA患者Th1、 Th2及Th17細(xì)胞亞群數(shù)量和比例， 試圖分析依那西普對(duì)其的影響， 進(jìn)一步闡述依那西普治療機(jī)制， 為臨床提供理論依據(jù)。
本研究通過(guò)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色FCM檢測(cè)外周血中Th細(xì)胞數(shù)量和比例的變化， 發(fā)現(xiàn)治療前活動(dòng)期RA患者Th1、 Th17細(xì)胞數(shù)量及平均熒光強(qiáng)度均高于健康對(duì)照組， 而Th2細(xì)胞無(wú)明顯差異， 導(dǎo)致Th1/Th2相對(duì)比例增高。進(jìn)一步通過(guò)ELISA分析體外培養(yǎng)PBMC上清中相應(yīng)細(xì)胞因子的水平， 證明IL17水平也高于健康對(duì)照組。研究結(jié)果提示， 在活動(dòng)性RA患者外周血中， Th1尤其是Th17細(xì)胞亞群處于主導(dǎo)地位。與MTX組相比， 聯(lián)合治療組RA患者治療12周后， 其休息痛、 晨僵時(shí)間、 CRP及DAS28水平均明顯下降， 證實(shí)依那西普療效確實(shí)［7］。IFNγ+Th1細(xì)胞陽(yáng)性率下降， Th2細(xì)胞無(wú)明顯改變， Th1/Th2比值相對(duì)下降， 提示依那西普可能通過(guò)影響Th1、Th2細(xì)胞亞群的平衡發(fā)揮作用， 推其可能是依那西普治療RA的機(jī)制之一。
聯(lián)合治療后Th17細(xì)胞陽(yáng)性率及單個(gè)CD4+T細(xì)胞中IL17平均熒光強(qiáng)度明顯下降并接近健康對(duì)照， 且下降的幅度均高于MTX組。Th17細(xì)胞的量與RA患者CRP、 DAS28水平消長(zhǎng)呈正相關(guān)， 提示Th17細(xì)胞可能參與RA發(fā)生發(fā)展。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明依那西普治療RA的明顯療效與Th17在RA中發(fā)揮重要作用有關(guān)。推測(cè)可能通過(guò)阻斷TNFα使前炎性因子釋放減少或反向信號(hào)抑制細(xì)胞增殖或通過(guò)caspase3途經(jīng)促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡［8］， 從而下調(diào)分泌IL17的Th17細(xì)胞合成， 但二者在體內(nèi)相互作用的具體途徑有待于進(jìn)一步探索。
綜上所述， 本實(shí)驗(yàn)表明活動(dòng)期RA患者IL17+Th17細(xì)胞、 IFNγ+Th1細(xì)胞及Th1/Th2比值的增高， 可能參與RA發(fā)病機(jī)制; 依那西普治療后可明顯改善臨床癥狀和下調(diào)Th1和TH17細(xì)胞亞群， 可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th細(xì)胞亞群治療RA。
參考文獻(xiàn)
［1］Maini RN， Taylor PC. Anticytokine therapy for rheumatoid arthritis［J］. Annu Rev Med， 2000， 51: 207-229.
［2］Choy EH， Panayi GS. Cytokine pathways and joint inflammation in rheumatoid arthritis［J］， New Engl J Med， 2001， 344(12): 907-916.
［3］Moreland LW， Baumgartner SW， Schiff MH， et al. Treatment of rheumatoid arthritis with a recombinant human tumor necrosis factor receptor (p75)Fc fusion protein［J］. New Engl J Med， 1997， 337(3): 141-147.
［4］Scott DL， Kingsley GH. Tumor necrosis factor inhibitors for rheumatoid arthritis［J］. New Engl J Med， 2006， 355(7): 704-712.
第5篇：一周學(xué)習(xí)計(jì)劃范文
周循環(huán)學(xué)習(xí)法如何實(shí)踐？
1、第一步：周日晚上制定周學(xué)習(xí)計(jì)劃。
根據(jù)自己總的學(xué)習(xí)進(jìn)度，制定一周的目標(biāo)。根據(jù)目標(biāo)計(jì)算周一到周六的學(xué)習(xí)量，制定可行的、但又必須完成的學(xué)習(xí)計(jì)劃。
2、第二步：周一至周六按計(jì)劃學(xué)習(xí)。
根據(jù)計(jì)劃學(xué)習(xí)量做好每日時(shí)間管理，每日結(jié)束前確認(rèn)一下計(jì)劃完成度，記錄學(xué)習(xí)日志；
3、第三步：周日徹底完成學(xué)習(xí)計(jì)劃。
把本周的學(xué)習(xí)完成情況總結(jié)一下。沒有完成的部分在周日徹底解決。一周計(jì)劃都完成了，就好好放松一下，然后做下周計(jì)劃。
一個(gè)相對(duì)完善的時(shí)間表，既要涵蓋每月的整體安排，又要包括每月以及每天、每
時(shí)的細(xì)節(jié)規(guī)劃。
復(fù)習(xí)計(jì)劃要留有余地，不要“滿打滿算”。比如，晚上7點(diǎn)到8點(diǎn)復(fù)習(xí)數(shù)學(xué)，8點(diǎn)開始復(fù)習(xí)英語(yǔ)，這樣安排就太緊了，當(dāng)中應(yīng)該有一個(gè)緩沖:7點(diǎn)到8點(diǎn)是數(shù)學(xué)時(shí)間，8點(diǎn)15分以后留給英語(yǔ)。這樣，數(shù)學(xué)復(fù)習(xí)完后喝口水，稍作休息，不要“連軸轉(zhuǎn)”。
而且，留有余地也可以確保上一段計(jì)劃的完成。還是以7點(diǎn)到8點(diǎn)復(fù)習(xí)數(shù)學(xué)為例，萬(wàn)一時(shí)間到了，卻還差一道題沒做完怎么辦?留有15分鐘的余地，孩子就可以具體問(wèn)題具體解決，而不致產(chǎn)生浮躁的情緒。
第6篇：一周學(xué)習(xí)計(jì)劃范文
有的同學(xué)在制定學(xué)習(xí)計(jì)劃時(shí)，只是寫上什么時(shí)間做什么，比如：6：00，起床；7：00，早讀；7：30-11：30，上課；12：00-1：30，午睡；1：30-4：30，上課；7：00-9：00，晚自習(xí)；10:00,熄燈。這樣得一份計(jì)劃太空洞，太無(wú)個(gè)性，任何人都可以適用。我們?cè)谥贫ㄓ?jì)劃時(shí)，要從自己的實(shí)際情況出發(fā)，于自己的學(xué)習(xí)目標(biāo)相配合。自己各科學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)不同，因而制定的各科學(xué)習(xí)目標(biāo)也不盡相同，那可比較薄弱，就應(yīng)該作為重點(diǎn)攻克的目標(biāo)，那么，在做計(jì)劃時(shí)就應(yīng)該分配較多的學(xué)習(xí)時(shí)間。因此，在制定計(jì)劃時(shí)，不能平均使用力量，要重點(diǎn)突出。
學(xué)習(xí)目標(biāo)一般可分為長(zhǎng)期目標(biāo)、中期目標(biāo)和近期目標(biāo)，相應(yīng)地，學(xué)習(xí)計(jì)劃也應(yīng)分為學(xué)期計(jì)劃、月計(jì)劃和周計(jì)劃及每天學(xué)習(xí)計(jì)劃。學(xué)期計(jì)劃于學(xué)期目標(biāo)相對(duì)應(yīng)，訂出一個(gè)學(xué)期學(xué)習(xí)的重點(diǎn)及各自的計(jì)劃要點(diǎn)；月計(jì)劃要與單元目標(biāo)相對(duì)應(yīng)，訂出一周的學(xué)習(xí)重點(diǎn)及每天的計(jì)劃要點(diǎn)。
2、學(xué)習(xí)計(jì)劃要與教師的教學(xué)計(jì)劃相配合
在制定每天具體的學(xué)習(xí)計(jì)劃時(shí)，要與老師的教學(xué)計(jì)劃緊密配合。具體說(shuō)就是要與每天課程表上計(jì)劃要上的課相配合，與每門課老師講授進(jìn)度相一致。例如，早晚自習(xí)時(shí)間學(xué)習(xí)計(jì)劃的安排，不但要于當(dāng)天課堂上老師講課的內(nèi)容相配合，而且還要與前一天和第二天老師的教學(xué)內(nèi)容掛鉤，不要拋開教師的教學(xué)進(jìn)度計(jì)劃，另搞一套。
3、學(xué)習(xí)計(jì)劃要有一定的靈活性
有的同學(xué)將每天除吃飯、睡覺以外的全部時(shí)間都安排了學(xué)習(xí)的內(nèi)容，排得滿滿的，連周六、周日都不安排一定休息的時(shí)間。這樣的計(jì)劃要執(zhí)行起來(lái)就相當(dāng)困難了。比如，星期天，同學(xué)一來(lái)玩，必然要陪同學(xué)一起玩，計(jì)劃就打亂了。因此，計(jì)劃要有一定的靈活性，不要把時(shí)間排的太滿、太死，要留出必要的休息和娛樂(lè)的時(shí)間，還應(yīng)留出一點(diǎn)激動(dòng)時(shí)間應(yīng)付可能出現(xiàn)的緊急情況。
第7篇：一周學(xué)習(xí)計(jì)劃范文
在整個(gè)小學(xué)階段,每個(gè)學(xué)期都要開設(shè)幾門課程,每周、每日學(xué)習(xí)的內(nèi)容都不同,各主要學(xué)科都要布置課外練習(xí),如果沒有學(xué)習(xí)計(jì)劃,就會(huì)手忙腳亂,雜亂無(wú)章,影響學(xué)習(xí)效果。教師要讓小學(xué)生明白制定學(xué)習(xí)計(jì)劃的重要性,明確學(xué)習(xí)計(jì)劃的內(nèi)容,掌握制定學(xué)習(xí)計(jì)劃的方法。
學(xué)習(xí)計(jì)劃包括長(zhǎng)期計(jì)劃和短期計(jì)劃兩種。長(zhǎng)期計(jì)劃以一學(xué)期為宜,從總體上對(duì)各學(xué)科的學(xué)習(xí)作出全面的安排。短期計(jì)劃以一周為宜,對(duì)本周內(nèi)每天的學(xué)習(xí)內(nèi)容、學(xué)習(xí)目的、保障措施和作息時(shí)間作出詳細(xì)具體的安排。
學(xué)習(xí)計(jì)劃要具體、明確、切實(shí)可行,同時(shí)又要留有充分的余地,以保證計(jì)劃的靈活性和適應(yīng)性。在執(zhí)行中既要堅(jiān)定不移,又要根據(jù)實(shí)際適當(dāng)調(diào)整,目的在于使學(xué)習(xí)計(jì)劃更加切合實(shí)際,更為有效地提高學(xué)習(xí)效果。
二、預(yù)習(xí)方法的輔導(dǎo)
預(yù)習(xí)也叫超前學(xué)習(xí),是指在教師上課之前,對(duì)所要學(xué)習(xí)的內(nèi)容提前進(jìn)行學(xué)習(xí)和理解的過(guò)程。預(yù)習(xí)既是有效的學(xué)習(xí)方法,也是良好的學(xué)習(xí)習(xí)慣。預(yù)習(xí)的方法是對(duì)第二天要講授的內(nèi)容認(rèn)真閱讀,仔細(xì)思考,把新的知識(shí)和以往學(xué)過(guò)的知識(shí)聯(lián)系起來(lái),看看哪些懂了會(huì)了,哪些不懂不會(huì),從而明確聽課的重點(diǎn)、難點(diǎn)和疑點(diǎn),克服課堂學(xué)習(xí)過(guò)程中的被動(dòng)性和盲目性,提高主動(dòng)性和自覺性,以利于提高學(xué)習(xí)效果。
三、聽課方法的輔導(dǎo)
課堂是學(xué)校教育的中心環(huán)節(jié),是學(xué)生獲得科學(xué)文化知識(shí)的主要途徑。如果小學(xué)生不會(huì)聽課,聽不懂,學(xué)不會(huì),就會(huì)增加課后復(fù)習(xí)的困難和壓力,造成不良循環(huán)。同時(shí)由于長(zhǎng)期積累,可能導(dǎo)致厭學(xué)心理,既不利于提高學(xué)習(xí)效果,也不利于心理健康。為此,在課堂教學(xué)中,要引導(dǎo)小學(xué)生注意以下幾點(diǎn)。
(1)認(rèn)真聽。要求小學(xué)生聚精會(huì)神地聽講,充分理解教師講課的內(nèi)容及其表達(dá)方式的含義,如節(jié)奏的快慢、聲音的高低等。
(2)注意看。要求小學(xué)生全神貫注地注視教師板書的內(nèi)容,對(duì)教師用彩色粉筆標(biāo)記的部分、用電化教具突出演示的部分尤其要仔細(xì)觀察,認(rèn)真領(lǐng)會(huì)和重點(diǎn)記憶。
(3)多動(dòng)腦。要引導(dǎo)小學(xué)生積極思考,要邊聽、邊看、邊思考,要與教師講課的進(jìn)程保持同步,要多問(wèn)幾個(gè)為什么,要把新舊知識(shí)聯(lián)系起來(lái)思考,做到融會(huì)貫通,舉一反三。
(4)主動(dòng)練。在課堂上要鼓勵(lì)小學(xué)生大膽發(fā)言,勤學(xué)多練,從而加深理解,提高聽課效果。
(5)做筆記。對(duì)教師講課中的要點(diǎn)、難點(diǎn)都要簡(jiǎn)明扼要地寫在筆記上,以備課后復(fù)習(xí)。
(6)善歸納。對(duì)教師課堂講授的內(nèi)容,要抓住綱目,歸納要點(diǎn),力求當(dāng)堂理解。
四、復(fù)習(xí)方法的輔導(dǎo)
復(fù)習(xí)是指對(duì)學(xué)過(guò)的知識(shí)重新學(xué)習(xí)的過(guò)程。復(fù)習(xí)包括課后復(fù)習(xí)和系統(tǒng)復(fù)習(xí)兩種。課后復(fù)習(xí)的主要目的在于理解和鞏固當(dāng)天學(xué)到的知識(shí)。系統(tǒng)復(fù)習(xí)的主要目的是對(duì)周、月、學(xué)期或?qū)W年學(xué)過(guò)的知識(shí)進(jìn)行全面深入的復(fù)習(xí),目的在于融會(huì)貫通,理解和掌握學(xué)科知識(shí)的體系。系統(tǒng)復(fù)習(xí)本質(zhì)上是對(duì)前段學(xué)習(xí)的知識(shí)進(jìn)行相對(duì)集中的再加工的過(guò)程。
課后復(fù)習(xí)的方法包括:
(1)回顧教師課堂講授的內(nèi)容及其過(guò)程,目的在于弄清哪些完全理解了,哪些沒有理解,使進(jìn)一步的復(fù)習(xí)具有鮮明的針對(duì)性和目的性;
(2)復(fù)習(xí)課本,目的在于深化;
(3)整理筆記,對(duì)課堂記得不完整或不準(zhǔn)確的地方加以補(bǔ)充和修正,使之更加系統(tǒng)、完整,便于復(fù)習(xí);
(4)對(duì)課本中不懂、不會(huì)的難點(diǎn)問(wèn)題,查閱工具書或參考書,力求弄懂弄通,實(shí)在弄不明白的,問(wèn)教師或與同學(xué)研究解決。
系統(tǒng)復(fù)習(xí)的方法也是多樣的。比如循環(huán)復(fù)習(xí)法,是指學(xué)過(guò)一個(gè)單元之后即及時(shí)復(fù)習(xí),然后再學(xué)下一單元,學(xué)完第二單元之后,再把這兩個(gè)單元綜合起來(lái)系統(tǒng)復(fù)習(xí),以此類推,循環(huán)至終。分配復(fù)習(xí)法,指學(xué)過(guò)的內(nèi)容及時(shí)復(fù)習(xí)之后在時(shí)間上每隔一定時(shí)期回過(guò)頭來(lái)再?gòu)?fù)習(xí),只是在時(shí)間間隔上逐漸拉長(zhǎng)。比如上一單元講過(guò)的內(nèi)容及時(shí)復(fù)習(xí),一周后再?gòu)?fù)習(xí),兩周后再回頭簡(jiǎn)略地復(fù)習(xí),一個(gè)月或一季度后再?gòu)?fù)習(xí)。事實(shí)表明,分配復(fù)習(xí)的效果優(yōu)于集中復(fù)習(xí)。當(dāng)然集中復(fù)習(xí)也有其優(yōu)勢(shì),比如在期末總復(fù)習(xí)時(shí),相對(duì)集中一段時(shí)間,對(duì)學(xué)習(xí)內(nèi)容中的重點(diǎn)、難點(diǎn)問(wèn)題,重點(diǎn)突破,進(jìn)行系統(tǒng)化的復(fù)習(xí),也是十分重要的。
五、寫作業(yè)方法的輔導(dǎo)
寫作業(yè)是學(xué)生經(jīng)過(guò)獨(dú)立思考,自覺、有目的地分析問(wèn)題、解決問(wèn)題,將學(xué)得的知識(shí)運(yùn)用于實(shí)際的智力活動(dòng)過(guò)程。通過(guò)寫作業(yè)可以檢查學(xué)生學(xué)習(xí)的結(jié)果,加深對(duì)知識(shí)的理解和記憶,充分發(fā)揮學(xué)生的智慧和潛力,同時(shí)也有助于培養(yǎng)學(xué)生的思維能力,養(yǎng)成良好的學(xué)習(xí)態(tài)度和學(xué)習(xí)習(xí)慣,因而教師要引導(dǎo)小學(xué)生掌握寫作業(yè)的正確方法。
(1)先復(fù)習(xí)后寫作業(yè),即在認(rèn)真復(fù)習(xí)、充分理解的基礎(chǔ)上完成作業(yè)。
(2)仔細(xì)審題,即了解題意,明確習(xí)題的目的要求,弄清已知條件和未知條件及解決問(wèn)題的關(guān)鍵所在,做到心中有數(shù)。
(3)認(rèn)真表述,即思路清晰,表述確切,書寫規(guī)范,答案準(zhǔn)確,干凈利落。
第8篇：一周學(xué)習(xí)計(jì)劃范文
1.提高自己在語(yǔ)文、數(shù)學(xué)等方面的學(xué)習(xí)潛力。
2.加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)，提高身體素質(zhì)。
3.學(xué)會(huì)做簡(jiǎn)單的家常菜。
二、暑假學(xué)習(xí)計(jì)劃具體方案：
1.針對(duì)自己的薄弱學(xué)科的學(xué)習(xí)態(tài)度、學(xué)習(xí)方法、學(xué)習(xí)目標(biāo)進(jìn)行反思，調(diào)整。
2.在家長(zhǎng)的指導(dǎo)下，寫好自己切實(shí)可行的暑假生活、學(xué)習(xí)計(jì)劃。(安排好每一天復(fù)習(xí)進(jìn)度的明細(xì)資料)
3.把練習(xí)卷上做正確的題目進(jìn)行整理，確認(rèn)自己已經(jīng)掌握了哪些知識(shí)，具備了哪些運(yùn)用潛力，樹立自己對(duì)本學(xué)科的信心。
4.把練習(xí)卷上做錯(cuò)的題目進(jìn)行整理、抄錄，打開教科書，逐題進(jìn)行分析，找到錯(cuò)誤的關(guān)鍵之處，進(jìn)行認(rèn)真的訂正后，再到教材上找到相關(guān)類型的題目，進(jìn)行練習(xí)、強(qiáng)化。(盡可能用自己的力量解決問(wèn)題)
5.遇到無(wú)法解決的困難，按教科書的學(xué)習(xí)順序進(jìn)行梳理羅列。了解自己學(xué)習(xí)問(wèn)題的共性薄弱點(diǎn)，然后能夠請(qǐng)老師一齊幫忙解決。
6.每周二次帶著學(xué)科的不懂之處和老師一齊分析、解決問(wèn)題。回家后運(yùn)用老師解決問(wèn)題的方法進(jìn)行自我強(qiáng)化練習(xí)，填補(bǔ)自己的學(xué)習(xí)漏洞。(這一點(diǎn)務(wù)必按照教材由淺入深的學(xué)習(xí)順序，切不可東一榔頭西一棒的無(wú)序)
7.每次完成習(xí)題的訂正，將錯(cuò)題訂正的全過(guò)程，牢牢地記在腦海里(背出)，漸漸地構(gòu)成解題方法的量的積累。
8.看名著，中高考時(shí)，會(huì)出現(xiàn)名著中的經(jīng)典片段，看幾本必看的小說(shuō)是中學(xué)生必需要做的事情之一，即可增長(zhǎng)見識(shí)，又可陶冶情緒。
9.一星期打兩次球，游三次泳，增加運(yùn)動(dòng)，提高體能。(也能夠聽音樂(lè)等，做自己有興趣的事)
9.一星期跟著父母學(xué)做兩次家常菜，如炒茄子，蒸魚之類，再做一些力所能及的家務(wù)。
三、暑假計(jì)劃具體安排：
1.一星期學(xué)習(xí)五天，上午2.5小時(shí)，下午2.5小時(shí)。按一小時(shí)一節(jié)課安排好課表。
2.每一天的3點(diǎn)以后是運(yùn)動(dòng)或做家務(wù)的時(shí)間。(也能夠安排一些適宜的娛樂(lè)活動(dòng))
四、家長(zhǎng)一齊參與孩子計(jì)劃：
1.設(shè)計(jì)好每一天的生活、學(xué)習(xí)評(píng)價(jià)表，對(duì)自己每一天的生活、學(xué)習(xí)作好評(píng)價(jià)。最新中學(xué)生暑假學(xué)習(xí)計(jì)劃最新中學(xué)生暑假學(xué)習(xí)計(jì)劃。
2.家長(zhǎng)一周三次檢查學(xué)生的暑期生活、學(xué)習(xí)計(jì)劃執(zhí)行的狀況和進(jìn)度，及時(shí)幫忙解決執(zhí)行中的困難。
3.家長(zhǎng)在幫忙學(xué)生執(zhí)行計(jì)劃時(shí)，也要尊重學(xué)生的要求，切不可急躁。要重視學(xué)生學(xué)習(xí)態(tài)度的調(diào)整和學(xué)習(xí)興趣的提高。
4.雙休日去看一些有益的展覽會(huì)，或參加一些有益的社會(huì)活動(dòng)。
第9篇：一周學(xué)習(xí)計(jì)劃范文
20xx高一學(xué)生寒假學(xué)習(xí)計(jì)劃范文1末考試成績(jī)可以作為同學(xué)們制定學(xué)習(xí)計(jì)劃重難點(diǎn)復(fù)習(xí)安排的學(xué)習(xí)依據(jù)。學(xué)習(xí)的好壞最關(guān)鍵也最終取決于你的學(xué)習(xí)效率!”能學(xué)會(huì)有效率地做事，對(duì)你一生都有極大的幫助和提高。面對(duì)于中國(guó)的應(yīng)試教育，你在當(dāng)學(xué)生時(shí)，你必須學(xué)會(huì)兩樣：1.有效率地做事。2學(xué)會(huì)如何學(xué)習(xí)。
1、早晨合理安排30分鐘學(xué)習(xí)英語(yǔ)，聽網(wǎng)校的英語(yǔ)聽力，歷史和地理背誦。
2、利用2節(jié)課的時(shí)間分別完成2份寒假作業(yè)，要記住，獨(dú)立完成。
3、網(wǎng)?，F(xiàn)已上傳一部分新卷子，集中一塊時(shí)間做一套。
4、下午和早晨一樣，利用2節(jié)課時(shí)間做2份寒假作業(yè)，但不可一下子貪多。要均衡、科學(xué)安排。
5、完成當(dāng)天寒假作業(yè)可以安排自由活動(dòng)，(如果玩電腦游戲不可超過(guò)一小時(shí))。
6、晚上是你自由活動(dòng)的時(shí)間，但要看看新聞。積累實(shí)時(shí)材料，尤其是準(zhǔn)備學(xué)文科的學(xué)生。
7、在寒假期間有可能的話，每天讀一讀文學(xué)作品，寫一寫自己讀后的感想，字?jǐn)?shù)可多可少，但不能不寫。
8、寫寒假作業(yè)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)自己本學(xué)期知識(shí)點(diǎn)學(xué)習(xí)不透徹的情況下可以通過(guò)網(wǎng)校來(lái)查漏補(bǔ)缺。
提高學(xué)習(xí)效率并非一朝一夕之事，需要長(zhǎng)期的探索和積累，同學(xué)們必須充分結(jié)合自己的特點(diǎn)。影響學(xué)習(xí)效率的因素，有學(xué)習(xí)之內(nèi)的，但更多的因素在學(xué)習(xí)之外。高中生都有很好的自制力。首先要養(yǎng)成良好的學(xué)習(xí)習(xí)慣，合理利用時(shí)間，另外還要注意"專心、用心、恒心"等基本素質(zhì)的培養(yǎng)，對(duì)于自身的優(yōu)勢(shì)、缺陷等更要有深刻的認(rèn)識(shí)。
20xx高一學(xué)生寒假學(xué)習(xí)計(jì)劃范文2高一上學(xué)期期末考試已經(jīng)結(jié)束了，高一年級(jí)學(xué)生就要面臨高二的文理分科。高一寒假學(xué)習(xí)計(jì)劃對(duì)自身做個(gè)清晰、理性的分析，確定自身優(yōu)勢(shì)，為學(xué)文、學(xué)理尋找理由就顯得頗為重要。大概方向確定后，就要明確自己所選擇的方向中，哪些學(xué)科要參加高考，哪些只需通過(guò)會(huì)考，從現(xiàn)在起就可以相應(yīng)地制定出針對(duì)不同科目的不同“用力”方法，將自己高中的時(shí)間、精力做到合理分配。 依常規(guī)來(lái)看，多數(shù)學(xué)生會(huì)選擇學(xué)理——未來(lái)的升學(xué)、就業(yè)面相對(duì)更寬。學(xué)習(xí)理科，數(shù)、理、化就全部是考試科目，而數(shù)理化的難點(diǎn)都在高一。因此，高一寒假必須做的就是把上學(xué)期沒有學(xué)會(huì)的內(nèi)容學(xué)明白。有一些知識(shí)的掌握是為了以后更好應(yīng)對(duì)相關(guān)知識(shí)點(diǎn)，如果高一就出現(xiàn)漏洞，未來(lái)所有相關(guān)知識(shí)也都會(huì)關(guān)聯(lián)出現(xiàn)問(wèn)題。
值得注意的是，高一的學(xué)習(xí)量很重，很多學(xué)生往往在第一學(xué)期還不太會(huì)調(diào)控。因此，高一學(xué)生第一學(xué)期的功課或多或少都會(huì)有落下的地方，這就需要利用寒假進(jìn)行調(diào)整、提高、填補(bǔ)工作，甚至可以說(shuō)，寒假能否利用好，對(duì)未來(lái)三年的狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生重要的影響。
高一寒假學(xué)習(xí)計(jì)劃時(shí)間安排：
7：00 起床
7：20 洗涑完畢 之后跑步：繞樓2樓(7：20----8：00)
8：05 吃飯
8：20---8：50 背單詞
8：55---9：25 背課文
9：35---10：35 數(shù)學(xué)
10：45---11：45 英語(yǔ)
11：45---12：00 課外書
12：00---13：00 午休
13：10---14：10 化學(xué)
14：20---15：10 物理
15：20—16：20 語(yǔ)文
16：20---吃晚飯前 free
吃完飯后—21：00 六科任選
21;00—22：00 電視，電腦，課外書
20xx高一學(xué)生寒假學(xué)習(xí)計(jì)劃范文3周一至周四 ：
1、每天在小筆記本上記下10~15個(gè)單詞(包括新舊單詞)，利用自己的課余時(shí)間將其背熟，一定要掌握，而且經(jīng)常拿出來(lái)復(fù)習(xí)。
2、晚飯前，先打開平臺(tái)，在“知識(shí)強(qiáng)化”欄目中找到當(dāng)天課堂所上過(guò)的內(nèi)容，認(rèn)真復(fù)習(xí)，該記住的要記住。
3、晚飯后，稍作休息，完成老師布置的作業(yè)。(注意：把回家作業(yè)當(dāng)考試做)
4、某一學(xué)科的一單元內(nèi)容結(jié)束，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行總復(fù)習(xí)，然后完成 “在線測(cè)試”里的題目。完成的不夠好的，復(fù)習(xí)一遍后重做，有做錯(cuò)的題目及時(shí)掌握。
5、預(yù)習(xí)第二天要上課的內(nèi)容，認(rèn)真做好記錄，把不懂的問(wèn)題帶到課堂上認(rèn)真聽老師講解。
6、聽“同步聽力”和“在線聽力”10~15分鐘，培養(yǎng)一種語(yǔ)感。
周五：
1、同做“周一至周四”中的1、2、3點(diǎn)。
2、將學(xué)習(xí)過(guò)程中留下的問(wèn)題在“名師答疑”中提問(wèn)。
3、有空時(shí)可以先放松一下自己，聽點(diǎn)輕音樂(lè)、看些課外的書(通過(guò)平臺(tái)或自己買的都可以)。
周六：
1、早上起來(lái)先做些運(yùn)動(dòng)，鍛煉身體，然后朗讀英語(yǔ)或語(yǔ)文的文章，把一些該記的內(nèi)容記住。
2、繼續(xù)完成老師布置的作業(yè)。
3、下午可打開“名師面授”，選擇一些自己薄弱的知識(shí)點(diǎn)聽?zhēng)妆椋m當(dāng)?shù)囟嘧鲆恍┰诰€測(cè)試。
4、把一周所學(xué)的復(fù)習(xí)一遍，通過(guò)“在線測(cè)試”欄目來(lái)檢查自己是否掌握。如果基礎(chǔ)不好的科目，學(xué)習(xí)“知識(shí)強(qiáng)化”。
5、針對(duì)自己的學(xué)科狀況針對(duì)性地選擇“名師答疑”的“精華區(qū)”中的問(wèn)題，把它當(dāng)作自己的問(wèn)題，先做一遍，再看老師的解答。
周日：
除做周六的內(nèi)容外，早晨或下午到分校進(jìn)行學(xué)習(xí)方法交流、測(cè)試、鞏固，晚上預(yù)習(xí)下周一的課程內(nèi)容。
