硬組織工程材料評析

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1生物學(xué)評價

1．1組織學(xué)評價

硬組織切片技術(shù)的應(yīng)用始于Donath等［16］1982年報道，該技術(shù)改變了傳統(tǒng)組織切片需先脫鈣才能切片的方法，使附著有軟組織的骨組織不經(jīng)脫鈣即可切成5～15μm薄片，以供組織學(xué)染色檢查，這種效果是常規(guī)石臘切片或樹脂切片觀察所不能代替的。硬組織切片技術(shù)可使植入物－組織界面及周圍軟組織結(jié)構(gòu)保持完整。界面骨組織的量和特性，可用相應(yīng)的組織形態(tài)測量工具來測定。該技術(shù)的主要特點是可以測量分析關(guān)節(jié)假體和螺釘?shù)冉饘僦踩胛锊牧系墓钦?。至于材料的生物相容性、材料表面結(jié)構(gòu)形態(tài)的生物學(xué)效應(yīng)以及材料負荷前后的具體組織學(xué)變化，均可在細胞學(xué)水平上得到滿意分析［17，18］。相比而言，常規(guī)組織學(xué)切片需要標本脫鈣和脫金屬，因此無法得到上述數(shù)據(jù)。應(yīng)用硬組織切片技術(shù)也能研究到硬組織工程材料被多核巨噬細胞吞噬的積極吸收過程，界面組織的巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)有時可觀察到植入材料顆粒。隨著技術(shù)改良，硬組織切片逐漸克服了界面裂隙和材料脫片等問題［19］，已經(jīng)成為評價植入物材料骨整合的金標準。常規(guī)染色，包括蘇木精－伊紅（HE）染色、甲苯胺藍染色及Masson染色等。HE染色主要用于觀察植入材料周圍淋巴細胞、巨噬細胞浸潤情況，材料與周圍軟組織的關(guān)系及材料對骨膜成骨的影響；甲苯胺藍染色后成骨細胞、破骨細胞、骨細胞呈藍色；Masson染色后骨小梁呈藍色，成骨細胞、破骨細胞呈粉紅色，類骨質(zhì)為大紅色［20］。這些成熟的染色技術(shù)，是目前骨整合組織學(xué)評價中常用的組織顯色方法。免疫組織化學(xué)染色，是目前骨整合分子機制研究中的一個重要方法。它應(yīng)用免疫學(xué)基本原理———抗原抗體反應(yīng)（即抗原與抗體特異性結(jié)合），通過化學(xué)反應(yīng)使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素等）顯色，以確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)等）并對其進行定位、定性及定量研究，故稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細胞化學(xué)技術(shù)。目前研究已知，骨整合過程中存在一些重要的小分子“信使”，通過特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)骨整合形成；一些骨組織中的局部生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）－β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、胰島素樣生長因子（IGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，通常以自分泌和（或）旁分泌形式調(diào)節(jié)細胞增殖分化，促進界面骨組織修復(fù)愈合。免疫組織化學(xué)染色方法可以將這些小分子顯現(xiàn)出來，進而對其分布、密度等參數(shù)進行分析［21］。親骨熒光素染色法，在界面新骨形態(tài)計量研究中占據(jù)重要地位。四環(huán)素與新生骨組織中的鈣螯合后，在紫外線激發(fā)下可發(fā)出強烈的黃綠色熒光，因此在熒光顯微鏡下很容易觀察界面新生骨質(zhì)。熒光雙標記技術(shù)則可評估骨形成速度，通常分2個時間點給實驗動物注射四環(huán)素（或者第一次使用四環(huán)素標記，第二個時間點采用鈣黃綠素標記，以達到不同熒光顯色的效果），處死動物后制作硬組織切片，并通過測定2條熒光帶之間的寬度等參數(shù)來計算骨質(zhì)沉積速度（骨礦沉積率＝2條熒光標記線之間距離／標記間隔時間）［22］。此外，茜素紅染色也適用于對材料生物活性的體外研究，其原理是利用茜素紅與鈣發(fā)生反應(yīng)可產(chǎn)生深紅色的化合物，使在材料表面接觸培養(yǎng)的成熟成骨細胞分泌沉積的鈣結(jié)節(jié)被明顯染色，并通過計算鈣結(jié)節(jié)大小和密度等參數(shù)來判定材料促進成骨的能力。

1．2細胞與分子生物學(xué)評價

材料植入體內(nèi)時存在成骨細胞與其他細胞（如成纖維細胞等）的表面競爭貼附，因此在評估種植材料的生物活性時觀察材料是否能夠促進成骨細胞在其表面早期大量附著，并形成良好的細胞形態(tài)和功能，是一個重要指標［23］。在眾多材料－骨界面體外實驗?zāi)Ｐ脱芯恐?，都將成骨細胞在種植材料表面的增殖能力和功能表達，視作評價材料生物活性的一項重要參數(shù)［24］。掃描電鏡可以清晰直觀地觀察研究體外培養(yǎng)的成骨細胞在材料試樣表面的接觸、黏附、伸展、分裂增殖、分泌細胞外基質(zhì)和凋亡過程。但是，掃描電鏡僅能對體外標本進行觀察，無法對植入物的體內(nèi)骨整合進行評價，而目前體外實驗還難以模擬出復(fù)雜的體內(nèi)微環(huán)境，因此目前掃描電鏡觀察僅可作為一種材料骨整合的輔助評價手段［25］。四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法和新型四甲基偶氮唑鹽（MTS）比色法的原理相似，即活細胞中的線粒體脫氫酶可將3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽還原而產(chǎn)生紫色結(jié)晶物，其結(jié)晶量與活細胞數(shù)量成正比。MTT溶解液萃取紫色結(jié)晶物后用酶標儀測定490nm處的光密度（OD）值，可反映活細胞數(shù)目。MTT法不足之處是產(chǎn)生的還原產(chǎn)物不溶于水，添加溶解液萃取的同時也使活細胞裂解死亡，不利于對材料－細胞相互作用的動態(tài)研究。經(jīng)改良，MTS法的還原產(chǎn)物可溶于細胞培養(yǎng)液，提取簡便，不損害實驗細胞［26］。骨鈣素是由分化成熟的成骨細胞分泌的一種非膠原骨基質(zhì)蛋白，是骨形成的決定因素，能夠調(diào)節(jié)礦物質(zhì)形成速率和方向。堿性磷酸酶（ALP）是參與骨組織再生、代謝的一種重要物質(zhì)。利用試劑盒測定在材料表面接觸培養(yǎng)的成骨細胞外骨鈣素水平，以及在細胞內(nèi)的ALP活性變化，可以了解成骨細胞分化成熟程度和細胞成骨礦化能力，從而反映材料的生物活性。ALP高表達可以啟動細胞外基質(zhì)礦化和鈣磷沉積過程，它的作用可能是通過促進機體局部形成高濃度PO43－，從而為骨組織內(nèi)羥基磷灰石（HA）的成核、結(jié)晶提供條件。逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈式反應(yīng)（RT－PCR）技術(shù)，是將RNA的反轉(zhuǎn)錄和互補DNA（cDNA）的聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)，可用于檢測細胞中基因表達水平。骨組織中成骨細胞的分化和增殖受到多種細胞因子的調(diào)節(jié)，因此對骨組織細胞因子的研究顯得尤為重要，RT－PCR技術(shù)可以對BMP、纖維粘連蛋白、血管內(nèi)皮生長因子、骨保護素等多種骨組織細胞因子的mRNA進行定量分析［27］。Kodama等［28］報道對鈦基進行表面改性，并利用RT－PCR技術(shù)檢測其表面成骨細胞中骨粘連蛋白和骨鈣素mRNA水平，以評價其表面的骨形成能力。

2醫(yī)學(xué)影像學(xué)評價

醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)在過去10多年發(fā)展迅猛。雙能X線吸收法（DXA）、外周骨定量CT（pQCT）和顯微CT（micro－CT）等已廣泛運用于臨床和基礎(chǔ)骨形態(tài)計量學(xué)研究，可提供骨（面、體）密度和微觀結(jié)構(gòu)的重要數(shù)據(jù)。納米CT（nano－CT）已在實驗室得到應(yīng)用，主要用于骨陷窩數(shù)量、大小和形態(tài)的定量研究。MRI技術(shù)有了很大發(fā)展，不僅可描述關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)，還可定量軟骨體積和生化成分的變化，其擴散張量成像（DTI）技術(shù)更可定量評價膠原纖維網(wǎng)絡(luò)的連接性和方向排列；MRI分辨率也不斷提高，目前臨床使用的3TMRI和試驗使用的7T顯微MRI（micro－MRI）均已達到微米級別［29］。因此，醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)已成為骨關(guān)節(jié)疾病臨床早期診斷和預(yù)后判斷的希望所在。隨著計算機軟硬件水平的提高和有限元技術(shù)在生物力學(xué)中不斷深入應(yīng)用，近年關(guān)于骨與關(guān)節(jié)生物力學(xué)研究已從傳統(tǒng)的對骨性結(jié)構(gòu)的簡單線性模擬，逐漸提高到對骨與關(guān)節(jié)及其附屬韌帶與肌肉組織的非線性仿真計算上。利用影像學(xué)技術(shù)（主要為CT和MRI）數(shù)據(jù)采集模式獲取原始數(shù)據(jù)，通過高仿真度非線性三維有限元分析與先進的生物力學(xué)離體標本測試手段探討骨與關(guān)節(jié)非線性力學(xué)特征，可為骨與關(guān)節(jié)穩(wěn)定性評估、骨與關(guān)節(jié)功能重建、骨科植入物研制、關(guān)節(jié)假體設(shè)計、脊柱畸形矯正等臨床重點難點問題提供理論指導(dǎo)。

2．1X線檢查

通過廉價簡便的X線攝片可隨時觀察植入物位置，并對植入物在體內(nèi)情況進行評分，通常參考Lane－SandhuX線片評分標準［30］。Tiedeman等［31］研究認為，這一評分標準與評價骨缺損愈合情況之骨密度、骨剛度、骨干重及抗扭曲強度等常用客觀指標有高度相關(guān)性，因此仍在一些實驗研究中應(yīng)用。但是，普通X線檢查對骨組織與生物材料界面的評估既缺乏敏感性也缺乏特異性，故目前僅用于對植入物置入位置及植入情況作簡單篩查。有研究將X線與組織切片技術(shù)相結(jié)合，得到高分辨率圖像，并應(yīng)用此技術(shù)對生物材料與骨組織界面上的相互作用進行評價。

2．2micro－CT

常規(guī)CT檢查由于分辨率偏低、金屬偽影較大等限制因素，一直無法廣泛應(yīng)用于生物材料與骨組織界面的分析研究，但是隨著micro－CT的產(chǎn)生，CT分辨率得到極大提高，掃描協(xié)議的改進也顯著減少了偽影干擾。近年來，有相關(guān)研究探討了含有金屬植入物骨組織標本的界面分析，如在關(guān)節(jié)假體松動模型中對金屬植入物－骨界面的評價，micro－CT掃描較傳統(tǒng)的硬組織切片方法具有更高的分辨率（最小可達2μm），同時通過三維重建可精確測量骨標本內(nèi)部骨小梁三維結(jié)構(gòu)參數(shù)與密度參數(shù)［32，33］，并可獲得三維立體的植入物－骨界面信息，對骨整合的評價更加客觀和全面。然而由于目前仍存在技術(shù)上的缺陷及缺乏有效的評價方法，micro－CT對骨整合的評價受到限制。一方面金屬物均會產(chǎn)生較強偽影，可干擾金屬與骨組織界面接觸的觀察和定量分析［34］；另一方面，由于軟件分析方面的限制，對骨整合界面的分析仍然停留在對金屬物內(nèi)骨長入量、骨小梁結(jié)構(gòu)、骨密度等方面的簡單評價，而這些指標并不能客觀、有效地評價植入物與骨組織之間的相互作用及結(jié)合強度，對骨整合及假體松動等的評價仍然缺乏說服力。但不可否認，隨著掃描協(xié)議的改進及圖像分析技術(shù)的提高，micro－CT對骨整合的評價仍然是今后的一個熱點。

2．3micro－MRI

近年來，MRI對于骨組織的顯像開始受到關(guān)注并取得了一些進展，定量MRI顯像為骨小梁的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了新的手段。它可以為一些疾病的進展和轉(zhuǎn)歸提供不同于CT的結(jié)構(gòu)信息。此外，MRI技術(shù)為骨丟失機制研究提供了完全無創(chuàng)的途徑，在一定程度上可補充甚至取代骨活檢功能。然而，目前在圖像的獲取與處理方面仍然有許多技術(shù)問題。受目前技術(shù)限制，MRI分辨率仍然不能夠滿意地評價骨小梁結(jié)構(gòu)，而且這種對于骨小梁結(jié)構(gòu)的有限分析仍主要局限于四肢骨骼，而臨床最為常見的骨折多發(fā)生于股骨近端和椎體。通過場強提高、脈沖技術(shù)改進以及參數(shù)矯正技術(shù)，一些不足正在得以改進。與CT和X線相比，micro－MRI不僅能夠區(qū)別出骨與非金屬類植入材料，而且可以將不同類型的軟組織區(qū)分開來。目前的研究顯示，micro－MRI圖像上的信號強度與組織學(xué)切片上組織結(jié)構(gòu)有明確關(guān)聯(lián)。有研究［29］認為，micro－MRI可用于分析脊椎融合過程中非金屬類植入物材料的骨整合過程，同時也可用于監(jiān)控可生物降解的網(wǎng)籠材料的降解過程；micro－MRI在評價與分析生物可降解性材料和非金屬類材料骨整合中將起到重要作用。隨著MRI分辨率不斷進步，臨床上運用MRI對這些材料的骨整合進行評價和分析將為之不遠?？傊?，micro－MRI有望成為評價早期骨整合的重要方法之一，在科研和臨床上發(fā)揮更大作用。

2．4核醫(yī)學(xué)顯像

臨床上，核醫(yī)學(xué)顯像在鑒別硬組織工程材料在人體內(nèi)骨組織界面發(fā)生的是無菌性抑或感染性松動方面，具有獨特優(yōu)勢。單純X線平片在兩者鑒別上既不靈敏也不特異，而CT斷層顯像及MRI因受到偽影的干擾而作用也十分有限，核醫(yī)學(xué)顯像反映的主要是病變的生理變化而不是解剖結(jié)構(gòu)，因而不受假體偽影的干擾，是目前比較公認的首選方法。單純99锝－亞甲基二膦酸鹽（99Tc－MDP）靜態(tài)顯像具有良好的陰性預(yù)測值，且可明確指出松動的具體部位，對術(shù)前評價病情有重要意義，可作為一項初步檢查。以往比較經(jīng)典的99Tc－MDP靜態(tài)顯像判斷假體無菌性松動或感染性松動的標準是將沿著假體周圍呈彌漫性分布的異常放射性濃聚判斷為伴發(fā)感染，而認為假體遠端或兩端骨組織放射性增高多為單純假體松動所致。可是有研究報道，99Tc－MDP靜態(tài)顯像對鑒別假體無菌性與感染性松動的準確率并不高。因此，有學(xué)者試用骨三相顯像來鑒別假體無菌性和感染性假體松動［35，36］，并顯示較高的特異度和敏感度。近年通過與CT技術(shù)相結(jié)合，核醫(yī)學(xué)顯像技術(shù)得到新發(fā)展。單光子發(fā)射CT（SPECT）與正電子發(fā)射斷層顯像（PET）同樣是功能性評價技術(shù)，它們與CT相結(jié)合后即產(chǎn)生SPECT／CT和PET／CT技術(shù)，相比一般核醫(yī)學(xué)成像，多了CT利于定位的優(yōu)勢［37，38］。近年這種技術(shù)開始應(yīng)用于對金屬植入物骨整合的評價［36］，其中對植入物相關(guān)性骨髓炎的診斷就很有價值［39］，其原理是基于對注射到患者體內(nèi)的一種放射性物質(zhì)產(chǎn)生的正電子進行檢測，而PET和CT聯(lián)合成像將使感染的診斷更加準確、及時。但是PET／CT對金屬植入物界面的評價也存在明顯缺陷，即PET／CT圖像中金屬偽影仍然比較明顯［40］。目前可通過多種方法減輕金屬植入物對PET／CT成像的影響，其最為徹底的辦法還有賴于CT重建算法的發(fā)展。針對消除金屬偽影的各種CT重建算法的效果已得到一定證實，但部分成果還未完全應(yīng)用于臨床，還需要經(jīng)過更多模擬和臨床試驗對這些方法的可靠性進行評估。

3生物力學(xué)分析

3．1傳統(tǒng)分析方法

近年有學(xué)者提出假體生物力學(xué)相容性的概念，認為良好的應(yīng)力分布是人工關(guān)節(jié)取得理想效果的前提條件。常用研究植入物生物力學(xué)性能的指標，包括頂出實驗、牽拉實驗、扭轉(zhuǎn)實驗等［41，42］。植入物的拆卸扭力常作為反映骨整合的生物力學(xué)尺度，因而植入物拆卸扭力增大，能反映種植體骨整合強度的增加［43］。對于植入物－骨界面形成骨整合后的力學(xué)分析實驗或模型的研究很多［41－44］，總體上傳統(tǒng)生物力學(xué)分析方法仍是目前評價植入物骨整合中生物力學(xué)參數(shù)的金標準，然而由于其為有創(chuàng)性等缺點，目前主要應(yīng)用于體外研究，并且難以對骨整合的生物力學(xué)參數(shù)進行動態(tài)分析。

3．2有限元分析方法

由于標本來源受限、實驗條件控制困難等原因，實驗生物力學(xué)的研究受到一定限制。計算機有限元分析法應(yīng)運而生。有限元這一概念最早出現(xiàn)于20世紀40年代，有限元分析法是一種用于結(jié)構(gòu)分析的矩陣方法，其在機械工程學(xué)的成功應(yīng)用促進了其在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究。有限元分析法應(yīng)用于骨生物力學(xué)研究已有30余年，并在人工關(guān)節(jié)、假肢等領(lǐng)域取得廣泛成功［45－47］。在人工關(guān)節(jié)領(lǐng)域［46］，有限元分析法主要應(yīng)用于對關(guān)節(jié)假體松動的力學(xué)分析，其中包括應(yīng)力分析、摩擦界面磨損分析、固定界面微動分析、關(guān)節(jié)活動度及穩(wěn)定性分析、骨整合和改建過程模擬等方面。假肢殘端與接受腔形成的人機界面［47］，是生物力學(xué)分析的另一個重要方面，也是有限元分析的另一個重要應(yīng)用領(lǐng)域，但是與其他力學(xué)問題不同的是，建立人機界面有限元模型，需要人體組織力學(xué)性能，而且更深入的問題是外力作用對人體組織的影響。Belytschko等［48］于1974年首次將有限元分析法用于脊柱生物力學(xué)研究，近幾十年來有限元分析法在脊柱生物力學(xué)研究中的應(yīng)用日益廣泛與深入［49－51］。由于植入物骨整合的復(fù)雜性，以往的實驗方法如電測法、光彈法等，難以獲得全域性信息。有限元分析法具有無創(chuàng)性、全息性的獨特優(yōu)勢，盡管目前仍然存在數(shù)學(xué)模型建立困難、難以建立合理的復(fù)雜問題簡化模型等問題，但今后仍可能成為生物力學(xué)分析的主要方法，具有廣闊前景。

4結(jié)語

近年骨科臨床和醫(yī)療器械制造業(yè)對于硬組織工程材料骨整合評價的需求均急劇增加，傳統(tǒng)生物學(xué)分析方法、新興醫(yī)學(xué)影像學(xué)及生物力學(xué)分析法由此得到重要改良和發(fā)展。一方面，傳統(tǒng)分析方法對生物材料骨整合的評價更趨于完善，并規(guī)避了一些常見問題，對骨整合的評價也越來越全面、深入，在分子和基因水平評價分析骨整合、探究機制方面取得了很多新成果；另一方面，新興醫(yī)學(xué)影像學(xué)及生物力學(xué)則為界面骨整合的分析提供了一種活體、無創(chuàng)、立體直觀、動態(tài)的分析方法，在很多方面彌補了傳統(tǒng)分析方法的不足，成為傳統(tǒng)分析方法對骨整合評價的重要補充?？梢灶A(yù)見，上述評價方法將繼續(xù)發(fā)展和改進，尤其是免疫組化技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、micro－MRI／micro－CT以及有限元分析法等，有望為硬組織工程材料骨整合機制研究與應(yīng)用評價作出更大貢獻，最終助力于研發(fā)出性能更加優(yōu)異的醫(yī)用材料。