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脂肪干細(xì)胞在泌尿系統(tǒng)疾病中的研究

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脂肪干細(xì)胞在泌尿系統(tǒng)疾病中的研究

摘要:脂肪干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)是一類從脂肪分離出來(lái)的具有自我更新及多向分化潛能的成體干細(xì)胞,AD-SCs具有高度的可塑性,可分化成多種類型的細(xì)胞。與其他干細(xì)胞相比,ADSCs具有來(lái)源充足,取材方便,供體易接受等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),已成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床治療的研究熱點(diǎn)。ADSCs誘導(dǎo)分化和移植可有效治療多種組織損傷性疾病,改善或修復(fù)器官功能,近年來(lái)ADSCs作為細(xì)胞療法及組織工程的新型種子細(xì)胞在泌尿系統(tǒng)疾病治療中取得了重大進(jìn)展。本文重點(diǎn)討論ADSCs的生物學(xué)特性及其在泌尿系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞:脂肪干細(xì)胞;泌尿系統(tǒng)疾?。唤M織工程

前言

脂肪干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)是從脂肪分離獲得、屬于中胚層來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。ADSCs最初是由Zuk等[1]人利用負(fù)壓抽脂術(shù)從脂肪組織懸液中分離培養(yǎng)出的類成纖維樣細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)它們?cè)谔囟ㄕT導(dǎo)條件下,可定向分化成脂肪細(xì)胞,軟骨細(xì)胞,成肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞,并首次證實(shí)其為多功能干細(xì)胞。近年來(lái),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowderivedstemcells,BMSCs)一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn),但由于其提取困難,來(lái)源較少,患者因疼痛較難接受等缺點(diǎn),使其在臨床應(yīng)用過(guò)程中受到極大的限制。2003年,DeUgarte實(shí)驗(yàn)室首次從同一患者體內(nèi)提取培養(yǎng)ADSCs和BMSCs,對(duì)其比較發(fā)現(xiàn),兩者在細(xì)胞形態(tài),生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué),細(xì)胞衰老,多向分化能力及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率五個(gè)方面均無(wú)顯著性差異[2]。而與BMSCs相比,ADSCs具有來(lái)源充足,提取簡(jiǎn)單,易自體取材,對(duì)供體傷害小等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),使其有望成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨床治療的新型種子細(xì)胞。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道,ADSCs可誘導(dǎo)分化成腎臟上皮細(xì)胞,并在膀胱及輸尿管修復(fù)中取得了初步進(jìn)展,在很大程度上解決了腎臟和尿路器官的修復(fù)與重建及免疫排斥等諸多棘手難題[3-6]。本文主要就ADSCs的生物學(xué)特性及其在泌尿系統(tǒng)疾病中的作用和機(jī)制作以簡(jiǎn)要綜述。

1ADSCs的生物學(xué)特性

1.1ADSCs的細(xì)胞形態(tài)

ADSCs為貼壁細(xì)胞,原代接種后5-7d為生長(zhǎng)滯后期,細(xì)胞呈梭形或圓形,核多居中,部分細(xì)胞可見(jiàn)雙核或多核,核漿比較大。經(jīng)傳代后,細(xì)胞增殖迅速,體積增大,細(xì)胞逐漸趨向成纖維樣生長(zhǎng),呈渦旋狀緊密排列。ADSCs穩(wěn)定性相對(duì)較好,經(jīng)多次傳代后細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變[1]。

1.2ADSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

目前為止,ADSCs主要的分離培養(yǎng)方式是將手術(shù)中取得的脂肪組織進(jìn)行反復(fù)沖洗和剪碎,制成脂肪組織懸液,用胰酶或膠原酶消化、離心后,棄去上層液體和殘余脂肪,培養(yǎng)液重懸沉淀后進(jìn)行培養(yǎng),大多選用的培養(yǎng)液為經(jīng)典的10%的胎牛血清成纖維培養(yǎng)液,最后經(jīng)0.25%胰酶消化,逐次傳至第三代后可獲得大量的脂肪干細(xì)胞系[7-9]。另外,目前尚未研究出鑒定ADSCs的特異性表面標(biāo)記,主要參照相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞及干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物進(jìn)行鑒別。綜合以往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),ADSCs主要表達(dá)CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49d、CD49e、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90、CD105、CD146、CD166、SH-3等,不表達(dá)CD31、CD34、CD45、HLA-DR,其中對(duì)于CD34的表達(dá)尚存在爭(zhēng)議[10-13]。然而,有研究表明以上這些標(biāo)記物的表達(dá)會(huì)因ADSCs獲取的部位,供體種類,手術(shù)類型,細(xì)胞密度及傳代次數(shù)的不同而具有差異性[14,15]。因此,只憑某些CD分子的表達(dá)來(lái)鑒定ADSCs是無(wú)可信性的,鑒定ADSCs最可行性的方法是進(jìn)行多系定向誘導(dǎo)分化,檢測(cè)分化細(xì)胞的相應(yīng)指標(biāo),若誘導(dǎo)成功則可間接證實(shí)ADSCs具有干細(xì)胞特性。如ADSCs向平滑肌分化的潛能可以根據(jù)誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)及特異性標(biāo)記物來(lái)鑒定。若細(xì)胞形態(tài)由成纖維樣變成紡錘狀肌束,且α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白及肌球蛋白重鏈表達(dá)呈陽(yáng)性,表明ADSCs已成功誘導(dǎo)分化為向平滑肌細(xì)胞[16]。

2ADSCs在泌尿系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

2.1急性腎損傷

急性腎損傷(acutekidneyinjury,AKI)是一類發(fā)病率和死亡率都很高的腎臟疾病,目前臨床上最主要的治療手段是血液透析和腎移植,而前者只能短暫的代替腎臟的一部分功能,后者最大的挑戰(zhàn)是腎源短缺。干細(xì)胞移植的研究為腎臟疾病的治療提供了全新的思路和方法。Li等人[3]將人的脂肪干細(xì)胞(humanadipose-derivedstemcells,hADSCs)經(jīng)尾靜脈注入至缺血再灌注腎損傷模型的C57BL/6小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)在損傷早期hADSCs即可遷徙至小鼠腎臟,并分化成腎小管上皮細(xì)胞,這些分化的細(xì)胞逐漸增殖取代死亡的腎臟細(xì)胞,這說(shuō)明,hADSCs有效維持了腎臟結(jié)構(gòu)的完整性和后續(xù)的組織修復(fù)過(guò)程。然而,另有研究表明,經(jīng)小鼠尾靜脈注射后,ADSCs進(jìn)入血液循環(huán)后主要?dú)w巢至肺臟,并非受損的腎臟,并且,在手術(shù)當(dāng)天和術(shù)后前兩天持續(xù)尾靜脈注射,可有效減輕腎小管上皮細(xì)胞壞死及間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的程度[17]。為提高干細(xì)胞在腎臟內(nèi)的歸巢效率,Lee等人[18]采用腎內(nèi)動(dòng)脈直接注射法,使誘導(dǎo)的干細(xì)胞直接進(jìn)入受損腎臟,結(jié)果顯示,臨近干細(xì)胞周圍的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯減少,這意味著腎內(nèi)動(dòng)脈直接注射可有效增加移植細(xì)胞的數(shù)目。但該注射法必須借助導(dǎo)尿術(shù)和血管造影術(shù)或X線才能順利操作。綜上所述,靜脈注射雖操作簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷性小,但干細(xì)胞向腎臟的歸巢數(shù)目較少;而腎內(nèi)動(dòng)脈直接注射雖能提高干細(xì)胞歸巢量,但操作較難,創(chuàng)傷性大,并且兩種方法中干細(xì)胞存活率都很低。針對(duì)這一難題,Gao等人[4]首次將ADSCs與組織工程材料--溫敏性氯化殼聚糖(chitosanchloride,CSCI)水凝膠相結(jié)合,以CSCI水凝膠為載體,直接將ADSCs注射至AKI腎臟皮質(zhì)之內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn),ADSCs復(fù)合CSCI水凝膠共同注射移植不僅能夠改善ADSCs在腎臟內(nèi)的滯留和存活,還可以顯著增加微血管密度,進(jìn)而促進(jìn)腎小管的修復(fù)和再生,而且4周后注射部位CSCI水凝膠為HE染色陰性,這說(shuō)明CSCI水凝膠具有良好的組織相容性和生物降解性。因此,利用組織工程材料作為ADSCs的細(xì)胞載體在很大程度上解決了移植細(xì)胞低滯留低存活的難題,在AKI疾病治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2輸尿管損傷

輸尿管損傷最常見(jiàn)的誘因?yàn)獒t(yī)源性和外傷性,損傷所致的并發(fā)癥主要表現(xiàn)為輸尿管狹窄、缺損,尿外滲及尿路梗阻等。若輸尿管缺損程度較小,可采用輸尿管斷端吻合術(shù)或輸尿管膀胱吻合術(shù)等手術(shù)方法進(jìn)行治療和修復(fù)。而輸尿管缺損程度較大或伴隨嚴(yán)重并發(fā)癥者,通常需要進(jìn)行輸尿管代替。目前最常用的輸尿管代替物為胃腸道,腸代輸尿管法雖然解決了輸尿管缺損和尿外滲,但容易引起腸粘連,慢性感染及尿結(jié)石等并發(fā)癥[19]。對(duì)此,輸尿管組織工程學(xué)逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Zhao等人[20]首次將ADSCs與生物材料相結(jié)合用于輸尿管組織重建,他們首先將兔來(lái)源的ADSCs誘導(dǎo)分化成平滑肌細(xì)胞(smoothmusclecells,SMCs),然后將SMCs接種至血管細(xì)胞外基質(zhì)(Vesselextracellularmatrix,VECM)支架的表面,共培養(yǎng)1周后,將攜帶SMCs的VECM移植到尿路缺損的新西蘭白兔動(dòng)物模型中,16周后取材發(fā)現(xiàn)移植處形成復(fù)層上皮組織肌束,并且靜脈尿路造影未發(fā)現(xiàn)輸尿管狹窄和腎積水并發(fā)癥。而后有研究相繼報(bào)道了一種新型的人工-天然復(fù)合型支架材料,該研究以聚乳酸(polylactideacid,PLA)為原料制作輸尿管螺旋形支架的內(nèi)層,以PLA/I型膠原為混合材料制作支架的外層,利用Transwell間接共培養(yǎng)系統(tǒng)誘導(dǎo)hADSCs定向分化為尿路上皮細(xì)胞并將其種植于PLA/I型膠原支架的外層后一并植入裸鼠背部皮下組織內(nèi),成功構(gòu)建了輸尿管支架皮下植入的動(dòng)物模型。種植兩周后取材,結(jié)果顯示植入后無(wú)動(dòng)物死亡、無(wú)炎癥及感染發(fā)生,誘導(dǎo)后的hADSCs能浸潤(rùn)至支架的內(nèi)部并能表達(dá)尿路上皮細(xì)胞的標(biāo)志物[5]。以上研究給我們兩點(diǎn)提示:第一,ADSCs可作為理想的種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程學(xué);第二,PLA/I型膠原混合型三維新型支架具有良好的生物相容性。相關(guān)研究初步證實(shí)了ADSCs復(fù)合新型支架材料構(gòu)建的組織工程化輸尿管用以體內(nèi)原位替代的方法是可行的。

2.3下尿路疾病

近年來(lái),各種原因(年齡,糖尿病,肥胖,外傷等)導(dǎo)致的下尿路疾病的發(fā)病率越來(lái)越高。下尿路功能障礙雖然不能構(gòu)成生命威脅,但嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量,傳統(tǒng)的治療方法依舊會(huì)存在不同程度的缺陷和并發(fā)癥[21]。干細(xì)胞結(jié)合組織工程技術(shù)在下尿路修復(fù)重建中的應(yīng)用逐漸成為臨床治療的新策略。近些年,許多研究顯示ADSCs在膀胱及尿道重建的研究中已取得了初步性的進(jìn)展,主要以膀胱缺損,神經(jīng)源性膀胱,壓力性尿失禁及尿道缺損等下尿路疾病為研究熱點(diǎn)。ADSCs誘導(dǎo)分化成平滑肌細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞的潛能已被證實(shí)[6,22],這些證據(jù)為其在下尿路重建中的應(yīng)用提供了可行性。Huang等人[23]將ADSCs直接注入至高脂血癥大鼠動(dòng)物模型的膀胱體內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADSCs注射組血清總膽固醇和低密度脂蛋白水平顯著降低,并伴有血管和神經(jīng)密度的增加及排尿頻率的減少。這說(shuō)明,ADSCs可用于改善高脂血癥引起的膀胱過(guò)度綜合征尿急尿頻的癥狀。此外,ADSCs的這種作用在糖尿病膀胱功能障礙的2型糖尿病大鼠模型中也得到證實(shí)[24]。近年來(lái),隨著干細(xì)胞和組織工程技術(shù)的發(fā)展,ADSCs復(fù)合組織工程支架材料在膀胱及尿道修復(fù)重建中的應(yīng)用已陸續(xù)被報(bào)道,而且,相比之下發(fā)現(xiàn)支架材料TEPS(Tissue-engineeredprepucescaffold)可增強(qiáng)ADSCs的抗纖維化作用,減少組織化器官纖維瘢痕的形成[25-29]。另外,Yamamoto實(shí)驗(yàn)室首次對(duì)兩例壓力尿失禁患者進(jìn)行自體ADSCs移植注射治療,他們將處理過(guò)的患者自體ADSCs經(jīng)尿道注射至尿道括約肌和黏膜下層,經(jīng)過(guò)12周的術(shù)后觀察發(fā)現(xiàn)患者尿失禁的次數(shù)明顯減少,超聲波顯示尿道血流量顯著增加,并且患者術(shù)后未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[30]。這一結(jié)果初步表明,經(jīng)尿道注射自體ADSCs可成為臨床上治療壓力性尿失禁安全可行的手術(shù)方法,實(shí)現(xiàn)了自體ADSCs移植從動(dòng)物模型到臨床治療的成功過(guò)渡。

3ADSCs治療泌尿系統(tǒng)疾病的可能機(jī)制

盡管ADSCs的相關(guān)報(bào)道越來(lái)越多,但仍然不能確定AD-SCs在泌尿系統(tǒng)疾病中的具體修復(fù)機(jī)制。ADSCs發(fā)揮修復(fù)作用的機(jī)制既可能為ADSCs多潛能分化,也可能是其自身的旁分泌作用,目前為止兩方面都有證據(jù)支持。當(dāng)前普遍認(rèn)為ADSCs可誘導(dǎo)分化與泌尿性器官相關(guān)的多種細(xì)胞,如平滑肌細(xì)胞及尿路上皮細(xì)胞等密切聯(lián)系,這些來(lái)源于ADSCs的細(xì)胞逐漸增殖取代死細(xì)胞留下的空隙而達(dá)到器官修復(fù)的作用[3,31-32]。然而,Rehman等人用不含生長(zhǎng)因子的5%FBS基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)hAD-SCs,72h后發(fā)現(xiàn)hADSCs自身能夠分泌大量的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、少量的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。在低氧環(huán)境刺激下,這些生物活性因子的含量明顯增加,其中VEGF增加五倍之多,VEGF含量的增加可明顯改善hADSCs移植后血管生成的狀態(tài)。這意味著,hADSCs可通過(guò)調(diào)控自身旁分泌效應(yīng)來(lái)應(yīng)對(duì)外界刺激[33]。另有研究發(fā)現(xiàn),ADSCs移植后可通過(guò)抗氧化及抗炎性反應(yīng)特性發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用,并能促進(jìn)腎小管細(xì)胞的增殖,從而緩解大鼠急性缺血性腎損傷的癥狀[34]。以上結(jié)果提示我們:將ADSCs或其它干細(xì)胞過(guò)表達(dá)某些生物活性因子后是否能提高干細(xì)胞移植后的治療效果。Song等人建立了HGF過(guò)表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系,并將其種植到膀胱出口梗阻(Bladderoutletob-struction,BOO)模型的大鼠體內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HGF后可顯著減少膀胱內(nèi)膠原沉積[35],這說(shuō)明,干細(xì)胞過(guò)表達(dá)HGF后移植可成為膀胱纖維化疾病治療的新策略。雖然體外過(guò)表達(dá)在一定程度上能提高干細(xì)胞的移植效果,但是需要我們考慮的問(wèn)題還很多,比如選擇的載體是否具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率;怎樣確保載體能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定的在體內(nèi)表達(dá)以及移植后的載體是否會(huì)影響宿主細(xì)胞的活力等。這些問(wèn)題的探索和解決將有助于ADSCs在泌尿系統(tǒng)疾病中的臨床應(yīng)用。

4結(jié)語(yǔ)

綜上所述,ADSCs具有來(lái)源廣,易獲得,誘導(dǎo)分化能力強(qiáng),病人痛苦小、易接受等諸多優(yōu)點(diǎn),已成為組織工程中理想的種子來(lái)源,并在腎臟修復(fù)、輸尿管及下尿路重建中取得了初步性進(jìn)展,而ADSCs復(fù)合支架材料共移植進(jìn)一步解決了單純支架移植后導(dǎo)致的支架吸收和攣縮。雖然ADSCs在泌尿系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)研究中取得了很大的進(jìn)展,但ADSCs誘導(dǎo)分化及移植最終要過(guò)渡到人體內(nèi)進(jìn)行研究,而目前對(duì)ADSCs的研究仍處于動(dòng)物試驗(yàn)階段,并且ADSCs向泌尿系統(tǒng)靶器官的分化機(jī)制及其復(fù)雜的旁分泌效應(yīng)依舊處在探索階段,距臨床應(yīng)用還存在一定的差距,這些問(wèn)題的解決將有助于我們對(duì)ADSCs的研究更加清晰和完整,為泌尿系統(tǒng)組織工程技術(shù)在臨床應(yīng)用中帶來(lái)新的思路和突破。

作者:董孜璞 修有成 趙維明 劉贊 金承俊 夏舜堯 單位:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科