應用型生物工程專業(yè)綜合實驗課程實踐
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摘要：生物工程綜合實驗是生物工程專業(yè)的一門重要的綜合性實驗課程。根據(jù)學院實際情況，構建了以米曲霉蛋白酶基因的克隆表達、發(fā)酵、純化及其應用為主線的實驗教學課程，對該課程的教學內(nèi)容、教學安排、成績評定和教學效果等進行了教學實踐，并且取得了較理想的教學效果，可為同類地方院校應用型人才的培養(yǎng)提供參考。
一、開設生物工程本科專業(yè)綜合實驗課程的意義
學院根據(jù)教育部2012年出版的《普通高等學校本科專業(yè)目錄和專業(yè)介紹》，以及教育部高等學校生物科學與工程教學指導委員會的《生物工程專業(yè)規(guī)范》，將基因工程、生物分離工程、酶工程、微生物學、分子生物學、發(fā)酵工程和生物工程設備等課程作為專業(yè)核心課程［3-4］。這些專業(yè)核心課程以理論教學為主，部分課程也開設了相應的實驗課。由于生物工程專業(yè)開設的課程較多，涉及領域較廣，致使核心課程的授課學時受到限制，相關實驗課程以基礎性或者驗證性的實驗內(nèi)容為主，涉及綜合性實驗項目較少［5-6］。實驗課程采用常規(guī)教學模式，即學生課前預習實驗原理、步驟方法等，實驗員將實驗所有藥品和試劑準備好，授課過程中，學生按照實驗教材的實驗步驟“照單抓藥”式地完成實驗內(nèi)容［7］。這種教學模式有利于學生掌握基本操作技能與方法，突出單一知識點，但是調(diào)動學生的積極性和主動性較差，不利于學生對所學內(nèi)容的全面理解與應用，較難將所學知識全面融會貫通。為了達到培養(yǎng)應用型人才的培養(yǎng)目標，根據(jù)學院目前專業(yè)課程實驗課程的開設現(xiàn)狀，針對生物工程專業(yè)開設了“生物工程綜合實驗”課程。該課程符合廣東省部分生物工程類企業(yè)對基因工程、生物反應器、分離純化等基本的操作技能要求，該課程將多門專業(yè)核心課程的基礎理論和操作技能有機地融為一體，促進了學生對現(xiàn)代生物技術技能的理解和掌握，同時使學生具有了團隊合作精神，獨立思考完成實驗的能力，具備初步的科學研究思維意識和科研能力。
二、米曲霉蛋白酶基因的克隆表達、發(fā)酵、純化及其應用的綜合實驗課程設計模式
綜合性實驗是將基礎理論知識點與實驗操作基本技能進行有機的結合，由多個具有內(nèi)在關聯(lián)的小實驗組成，學生在實驗過程中必須認真做好每個小實驗，然后將所有小實驗結果有機串聯(lián)在一起，達到生產(chǎn)出具體產(chǎn)品或者解決具體問題的目的［8-9］。為了讓生物工程綜合實驗課程達到人才培養(yǎng)目標，盡量做到將專業(yè)核心課程的基本理論和基本操作技能有機融合，因此，選取了米曲霉蛋白酶基因的克隆表達、發(fā)酵、純化及其應用作為綜合實驗的教學內(nèi)容。由于蛋白酶是一類非常重要的工業(yè)用酶，占有全世界工業(yè)用酶至少60%以上份額，堿性蛋白酶又占總蛋白酶的一半以上，被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化工和皮革等行業(yè)；而當前商品化的堿性蛋白酶主要來源于細菌，來源于真菌的較少，從真菌中開發(fā)蛋白酶也就引起了國內(nèi)外學者的關注。米曲霉是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中重要微生物菌種，該菌產(chǎn)生的蛋白酶對大豆蛋白具有較強的水解作用，對大豆水解物中脫苦味和獨特風味具有非常重要的作用［10］。
（一）生物信息學實驗模塊
生物信息學實驗模塊主要由表1中2.1的“米曲霉堿性蛋白酶基因的序列分析及表達引物的設計”實驗內(nèi)容組成，該實驗要求學生利用BioEdit7.0序列軟件查看米曲霉堿性蛋白酶的基因序列及其編碼的氨基酸序列，利用GenBank數(shù)據(jù)庫的Blast程序對蛋白酶基因的序列分析，預測其信號肽、前導肽和成熟肽序列，利用Oligo7.0軟件對表達引物的設計，學會在引物上添加限制性內(nèi)切酶位點及保護堿基，以便在下一步實驗中獲得的PCR產(chǎn)物并順利酶切。
（二）基因工程實驗模塊
基因工程實驗模塊是整個綜合實驗的重要組成部分，主要由實驗2、實驗3和實驗4的內(nèi)容組成，該部分主要是對目的基因的PCR擴增、純化和酶切，然后將目的基因連接至提取出的質粒上，獲得重組表達載體，通過電轉化將該載體整合到畢赤酵母基因組上，對畢赤酵母轉化子基因組的提取，采用基因組PCR技術鑒定目的基因整合結果，通過一系列的基因工程實驗技術，讓學生加深對基因工程基本理論的理解，以及對基因工程常規(guī)操作技術具有熟練的掌握。
（三）發(fā)酵工程實驗模塊
發(fā)酵工程實驗模塊主要是由實驗5組成，利用基因工程實驗模塊構建的工程菌株，分別在三角瓶和發(fā)酵罐中進行誘導表達。在三角瓶中發(fā)酵采用500mL三角瓶裝液量為100mL；而在發(fā)酵罐中，采用逐步擴大培養(yǎng)方式，即用多個500mL三角瓶活化菌株后，接種到10L發(fā)酵罐中擴大培養(yǎng)，再接種至100L發(fā)酵罐中進行誘導表達。本實驗模塊讓學生認識到，采用不同的生物反應器培養(yǎng)，菌株的生長、產(chǎn)酶能力等都具有顯著的差異，通過理解發(fā)酵曲線（pH曲線、溶氧曲線、溫度曲線、補料曲線和攪拌速率曲線等）來判斷發(fā)酵罐中菌體的生長情況。
（四）生物分離工程實驗模塊
生物分離工程實驗模塊主要由實驗6和實驗8組成。本實驗模塊利用板框過濾技術或離心技術將菌體與發(fā)酵液進行分離，對發(fā)酵液中的重組蛋白酶采用膜分離技術進行濃縮，對濃縮后的發(fā)酵液采用硫酸銨鹽析、溶解透析獲得粗酶液。對大豆肽飲料采取等電點沉淀法去除未溶解的大豆分離蛋白，采用膜分離技術對其濃縮，提高大豆肽飲料中活性肽的含量。通過該實驗模塊讓學生理解生物產(chǎn)品分離中發(fā)酵液的預處理、沉淀分離、膜分離、生物產(chǎn)品的濃縮等原理及基本技能。
（五）酶工程實驗模塊
酶工程實驗模塊由實驗7和實驗8組成。該實驗模塊使學生認識到采用基因工程技術和發(fā)酵技術獲得蛋白酶，是目前制備酶制劑的重要方式之一。通過對重組酶的基本酶學性質的測定，獲得的最適合溫度、最適合pH等實驗結果，指導對大豆分離蛋白的水解，并制備出活性肽飲料。讓學生從實驗中理解酶學性質測定的重要性，以及了解蛋白酶在實際生產(chǎn)中的應用。
三、綜合實驗課程的教學實踐
（一）課程安排
開設綜合實驗課程要求學生已完成微生物學、分子生物、生物化學、生物工程設備、基因工程等課程的學習，因此，該課程安排在大學三年級的第二學期，采用集中授課的方式，共計80學時，全天候進行實驗，以確保實驗的連貫性和完整性。
（二）實驗分組情況
在實驗課程中，常常由于學生分工不明確，試劑、藥品和設備等數(shù)量的不足導致整個實驗課程嘈雜、教學秩序混亂，因此，本課程將3~4名學生分為一個小組，將常規(guī)的設備、試劑和藥品（如移液槍、三角瓶、燒杯、瓊脂粉等）分配到每個小組，由小組支配使用管理，直到本課程實驗全部完成后再歸還實驗室。
（三）課堂的組織教學
本課程采用學院的自編教材《生物工程綜合大實驗》，要求學生課前認真預習，理解實驗原理、操作步驟、注意事項等各個方面。每次實驗之前，任課教師對本次實驗的小實驗組成、實驗原理、小實驗間的關聯(lián)，可能會出現(xiàn)的問題、實驗結果的預測等方面均要向學生詳細講授，使學生理解本次實驗內(nèi)容。學生根據(jù)自己對實驗教材的預習情況，結合教師對實驗內(nèi)容的講授，小組內(nèi)學生之間相互討論，形成本小組的具體實驗方案后，才能動手做實驗。在實驗過程中，學生是實驗操作的主體，要求學生必須全程參與所有的實驗操作，即每個實驗環(huán)節(jié)都由學生自己完成，如培養(yǎng)基的制備、各種試劑溶液的配制等。指導教師主要是指導和監(jiān)督學生動手操作，及時糾正學生的錯誤操作，對學生每一階段的實驗結果進行總結與分析，針對實驗中出現(xiàn)的異常數(shù)據(jù)和現(xiàn)象要進行重點講解分析，這對擴展學生知識、提高學生解決實際問題，加深對基本理論知識的理解具有巨大的幫助作用。
（四）考核方法
實驗成績是衡量評定學生學習情況的根本依據(jù)，合理的成績評定方式，對提高學生對課程的重視程度，增強學生的積極性和主動性，提高學生的動手操作技能具有重要的作用［11-12］。本課程的成績評定主要是由3部分組成（考勤和團隊協(xié)作占10%、實驗操作動手能力占20%、實驗報告占70%）?！翱记诤蛨F隊協(xié)作”部分由小組長牽頭，以及組員間相互監(jiān)督來評定組員的分數(shù)?！皩嶒灢僮鲃邮帜芰Α庇芍笇Ы處煾鶕?jù)學生在整個實驗課程中的動手操作能力評定分數(shù)?！皩嶒瀳蟾妗辈糠钟蓪嶒瀳蟾娴母袷?、科學術語表述、語句通順情況、實驗結果以及對結果的分析等組成，實驗報告格式參照學校學報論文的撰寫格式，讓學生初步掌握論文的寫作規(guī)范，實驗結果中的表格、圖片等均要求提供原始數(shù)據(jù)和圖片，對實驗中出現(xiàn)異?，F(xiàn)象必須要有合理的解釋和說明。
四、結語
本綜合實驗課程是基于學院科研課題的基礎上形成的教學性實驗課程，與學校人才培養(yǎng)的理念和目標一致，對應用型人才的動手操作技能，同時對學生的科研思維和科研素質等的培養(yǎng)具有重要的作用。該綜合實驗課程已在兩屆學生（2013級和2014級）進行了開設，得到了學生的一致好評。由于該課程的每個實驗之間是相互關聯(lián)的，上一個實驗的結果是下一個實驗的材料，這就要求學生必須重視每一操作步驟和過程，如果出現(xiàn)錯誤，就必須重做，這就要求學生具備高度的責任心，每次實驗操作要認真負責確保成功，無形中提高學生的動手能力和操作技能；整個實驗是一個連續(xù)性的過程，實驗時間的安排與菌體生長、酶的反應時間、實驗室的學生人數(shù)等客觀因素相關，這就要求學生會合理規(guī)劃和安排實驗時間。在整個實驗過程中由學生自己動手操作、思考解決問題，讓學生加深了對理論知識的認識、理解和運用。據(jù)兩屆學生的反饋，該實驗課程的開設對求職或者考研的學生在面試、學習或工作中都具有極大的幫助。但是本課程才開設兩年，課程中還有較多不足的地方需要進一步的完善；同時隨著實驗室硬件設備的進一步改善，培養(yǎng)的學生將更符合當今時代對生物工程專業(yè)人才的需求。
作者：柯野 曾松榮 涂智蘋 單位：韶關學院英東生命科學學院
