生物醫(yī)學(xué)ESR自旋捕集技術(shù)運用

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1ESR自旋捕集技術(shù)

所謂自旋捕集技術(shù)就是為了檢測和辯認短壽命自由基,將一種不飽合的抗磁性物質(zhì)(稱自旋捕集劑,一般為氮酮和亞硝基化合物),加入要研究的反應(yīng)體系,生成壽命較長的自旋加合物,可以用ESR檢測.現(xiàn)在已經(jīng)合成上百種自旋捕集劑,最常用的自旋捕集劑有tNB(nitroso-tert-bu-tane),DMPO(5,5-dimethyl-1-pyrroline-1-oxide),PBN(phenyl-tert-butynitrone)等(如圖1),它們和自由基反應(yīng)都可以生成氮氧自由基,所得ESR波譜的一級分裂都是氮原子引起的三重分裂,這一點和自旋標記所得到的ESR波譜很類似.但是自旋加合物的ESR波譜常常被分裂為二、三級更復(fù)雜的圖譜,由二、三級分裂峰值的數(shù)目和強度可以推導(dǎo)出捕捉到自由基的結(jié)構(gòu)和性質(zhì).

1.1氧自由基的捕捉

超氧陰離子自由基不僅具有重要的生物功能和與多種疾病有密切相關(guān),而且它還是所有氧自由基中的第一個自由基,可以經(jīng)過一系列反應(yīng)生成其它氧自由基,因此具有特別重要的生物功能和意義.羥基自由基是已知的最強的氧化劑,它比高錳酸鉀和重鉻酸鉀的氧化性還強,是氧氣的三電子還原產(chǎn)物,反應(yīng)性極強,幾乎可以和所有細胞成分發(fā)生反應(yīng),對機體危害極大.因此,這2種自由基是利用自由基捕集技術(shù)研究最多的.DMPO是一種對氧自由基捕集效率很高的自旋捕集劑,而且形成的自旋加合物,DMPO-OH,DMPO-OOH,有特征的超精細分裂圖譜和超精細分裂常數(shù).DMPO-OH的ESR波譜由4條譜線組成,強度比為1∶2∶2∶1,這是由于N的超精細分裂常數(shù)等于H的超精細分裂常數(shù)的結(jié)果(aN=aH=1.49mT)(圖2),是用ESR技術(shù)判別羥基自由基的重要標志[1-7].超氧陰離子自由基DMPO自旋加合物的典型ESR波譜,DMPO-OOH的ESR波譜是由4組12條譜線組成的,其中aN=1.43mT,aHβ=1.17mT,aHγ=0.125mT.這類ESR波譜常被人們用來檢驗一個體系是否有超氧陰離子自由基產(chǎn)生的判據(jù)(圖3)[1-7].DMPO自旋加合物不穩(wěn)定,很難用于體內(nèi)氧自由基檢測,針對這一缺點,人們又合成了一系列新的自旋捕集劑,比較成功的有5-(Diethoxyphosphoryl)-5′-methyl-1-pyrro-lineN-oxide(DEPMPO),5-tert-butoxycarbonyl5-methyl-1-pyrrolineN-oxide(BMPO)和5-ethoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrrolineN-oxide(EMPO)[1];利用這些自旋捕集劑可以得到比較穩(wěn)定的可以檢測的ESR波譜(圖4).

1.2脂類自由基捕集

脂質(zhì)過氧化是一個產(chǎn)生自由基和自由基參與的鏈式反應(yīng).過去人們研究脂質(zhì)過氧化一般都采用TBA(thiobarbituricacid)法檢測脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的最終產(chǎn)物之一MDA(ma-lonaldehyde),這樣很難深入研究脂質(zhì)過氧化的自由基機理.利用4-POBN(4-pyridyl-1-oxide-N-t-butylnitrone)自旋捕集劑在亞油酸,脂質(zhì)體微粒體,突觸體和紅細胞膜等體系中捕捉到了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的脂類自由基(圖5),研究了它們產(chǎn)生的機理及天然抗氧化劑對脂類自由基的清除作用機理[1-4,8-10].

1.3單線態(tài)氧的捕集

單線態(tài)氧雖然不是自由基,但是高度活性常常反應(yīng)產(chǎn)生自由基.利用叔胺四甲基哌啶(TEMPONE)可以特異地檢測單線態(tài)氧,是3條等強度的ESR譜線組成的(圖6).為了證明體系中確實有單線態(tài)氧產(chǎn)生,往往還需要單線態(tài)氧的清除劑———胡蘿卜素證明.另外,四甲基乙烯(TME)、2,5二甲基呋喃(DMF)、9,10-二苯基蒽(DPA)等也可以淬滅單線態(tài)氧,用以證實單線態(tài)氧的存在.單線態(tài)氧在D2O中的壽命要比在H2O中長10~15數(shù)量級,這也是鑒別單線態(tài)氧存在的一個重要方法.若在反應(yīng)體系中加入D2O,用ESR檢測單線態(tài)氧產(chǎn)率增大,進一步證明體系中確實有單線態(tài)氧產(chǎn)生[1-4,10].

1.4NO自由基的檢測

NO是內(nèi)皮細胞松弛因子,能夠松弛血管平滑肌,防止血小板凝聚,是神經(jīng)傳導(dǎo)的逆信使,在學(xué)習(xí)和記憶過程及免疫和疾病中發(fā)揮著重要作用.NO是自由基,但由于它的自旋和軌道角動量偶合不能用ESR直接檢測.有3種ESR技術(shù)可以檢測溶液中的NO,一種就是傳統(tǒng)的氮氧自由基自旋捕集NO自由基,另一種是用鐵鹽絡(luò)合物.前者可以和NO反應(yīng)生成自旋加合物自由基,對化學(xué)體系產(chǎn)生的NO自由基捕集效果很好,但是很難用于細胞和生物體系;后者已經(jīng)成功地用于檢測體內(nèi)產(chǎn)生的NO自由基了.我們利用血紅蛋白檢測到了NO自由基(圖7).我們又用建立了DETC2-Fe2+絡(luò)合物檢測生物體內(nèi)產(chǎn)生的NO自由基,并且用有機溶劑抽提DETC2-Fe2+絡(luò)合物成功的檢測了組織和培養(yǎng)細胞中產(chǎn)生的一氧化氮自由基,使ESR自旋捕捉一氧化氮自由基的靈敏度提高50~100倍(圖7,8)[1,4,11-16].

1.5一氧化氮和氧自由基的同時檢測

在生物體內(nèi)和活細胞中,一氧化氮自由基和超氧陰離子自由基往往是同時產(chǎn)生的.人們過去一般是分別測定它們的產(chǎn)生和進行研究的,這樣就會造成一定誤差,同時也不方便.因此,我們實驗室建立了一種利用ESR自旋捕捉技術(shù),把體內(nèi)和活細胞中產(chǎn)生的一氧化氮自由基和活性氧自由基(ROS)同時捕捉住并進行檢測(圖9).這樣就可以既準確又方便地檢測和研究體內(nèi)和活細胞中產(chǎn)生的一氧化氮自由基和活性氧自由基的規(guī)律[1,4,17].

2ESR自旋捕集技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

2.1炎癥過程產(chǎn)生的自由基

炎癥是機體受到外界微生物入侵后的一種保護性反應(yīng).吞噬細胞在炎癥反應(yīng)中起著重要作用,它們在炎癥反應(yīng)時吞噬細菌,受刺激活化,產(chǎn)生呼吸爆發(fā),消耗氧氣,活化己糖磷酸化支路,釋放超氧陰離子自由基,過氧化氫和單線態(tài)氧,這些產(chǎn)物在殺傷入侵者的同時對正常機體組織也會產(chǎn)生損傷.我們用esr自旋捕集技術(shù)直接捕捉到了活化人多形核白細胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的活性氧自由基和NO自由基[1-6,15-16].

2.1.1巨噬細胞產(chǎn)生氧自由基的捕集

關(guān)于吞噬作用的生化機理研究最多的是肺巨噬細胞和血液中的中性粒細胞,因為它們可以方便地從支氣管灌流液和外周血中分離得到.在吞噬一開始,它們都明顯增加氧消耗,比休息狀態(tài)增加10~20倍,同時,起動己糖磷酸化支路,葡萄糖消耗急劇增加,稱為呼吸爆發(fā).而氰化物不能抑制這一氧消耗,說明與呼吸鏈無關(guān).呼吸爆發(fā)的啟動依賴對膜的擾動,因為不僅調(diào)理化的細菌,而且小乳膠粒,調(diào)理過的酵母多糖和一些化學(xué)試劑都能誘導(dǎo)巨噬細胞呼吸爆發(fā),這些化學(xué)試劑包括佛波醇(PMA),氟離子,小分子肽N-甲酰甲硫氨酰苯丙氨酸(fmet-leu-pne)和伴刀豆蛋白A等,因此呼吸爆發(fā)并不需要吞噬作用出現(xiàn).我們用ESR自旋捕集技術(shù)直接捕捉到了PMA刺激多形核白細胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的氧自由基證明在體系中產(chǎn)生的ESR信號主要來自PMA刺激多形核白細胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基及其歧化反應(yīng)生成的過氧化氫和羥基自由基(圖10)[1-6].

2.1.2巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮自由基的直接捕集

在3×107cell/mL的巨噬細胞體系中,捕集復(fù)合物(N-methyl-D-glucaminedithio-carbamate)(MGD)2Fe2+的濃度稀釋到0.4mmol/L.加入100ng/mLPMA和/或0.3mmol/LL-精氨酸混合后,混合物立刻轉(zhuǎn)入石英毛細管中,在ESR儀上于37℃檢測,每30s記錄一氧化氮ESR信號.一氧化氮捕集復(fù)合物((MGD)2Fe2+NO)給出三線峰ESR波譜,g因子為2.035,超精細分裂常數(shù)為1.25×10-3T(圖11).測量一氧化氮波譜第一條峰的高度,作為一氧化氮相對濃度[15,16].以上實驗結(jié)果充分說明,PMN受到PMA刺激,在免疫反應(yīng)時產(chǎn)生一氧化氮自由基.

2.2心臟病和自由基

心臟病是人類死亡率很高的一種疾病.缺血再灌注損傷會引起和加重人類很多嚴重疾病,如心臟病,中風(fēng),風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,運動損傷及器官的保存和移植.近來的研究結(jié)果表明,組織的缺血再灌注損傷與自由基有著密切關(guān)系.ESR自旋捕集技術(shù)在心臟病研究中的應(yīng)用,特別是在心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生自由基的研究報道很多[1-4,11-14,20,21].

2.2.1缺血再灌產(chǎn)生氧自由基的自旋捕集

將自旋捕集劑加入再灌注液一起灌注缺血心肌,或者在缺血再灌注前注射到體內(nèi),捕捉產(chǎn)生的自由基,目前使用的自旋捕集劑主要是PBN.我們用自旋捕集技術(shù)研究心肌缺血再灌注產(chǎn)生自由基和藥物對自由基的清除作用.用自旋捕集劑PBN捕捉到了大鼠心肌缺血再灌注產(chǎn)生的自由基.它的ESR波譜由2×3的6條譜線組成,是由缺血再灌注產(chǎn)生的氧自由基及與心肌細胞膜反應(yīng)產(chǎn)生的脂類自由基與PBN加合而成.加入SOD,金屬離子絡(luò)合物去鐵敏可明顯使這一信號減小,說明這一信號是由缺血再灌注產(chǎn)生的超氧陰離子自由基及羥基自由基引起的[1-3,21].

2.2.2缺血再灌產(chǎn)生一氧化氮自由基的捕集

一氧化氮自由基具有重要生物功能,對心血管既有保護作用又可能有損傷的“雙刃劍”作用在這里體現(xiàn)的非常清楚.心臟病,特別是心肌缺血再灌注損傷與一氧化氮自由基的關(guān)系引起人們的廣泛關(guān)注和興趣.不僅用生理生化方法進行了研究,而且也用ESR技術(shù)研究了缺血再灌注過程產(chǎn)生的一氧化氮自由基.我們利用3種不同方法研究在離體和在體缺血再灌注損傷中產(chǎn)生的一氧化氮自由基及其作用,心肌細胞缺氧再給氧產(chǎn)生的一氧化氮自由基的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,銀杏黃酮和知母寧等天然抗氧化劑對一氧化氮自由基的調(diào)節(jié)作用和對心肌的保護作用[1-4,11-14,20,21].

2.3神經(jīng)退行性疾病纏身自由基的研究

目前全球人口老齡化的趨勢日益明顯.最新人口普查表明,我國60歲以上的老年人口已達1.3億,已提前步入老齡化社會,到2050年我國老年人口數(shù)量將達到4.39億,占總?cè)丝诘?/4.我國是在社會、經(jīng)濟不太發(fā)達,各地區(qū)發(fā)展水平又不平衡的情況下進入老齡社會的,這種社會矛盾將給我國帶來比發(fā)達國家更多更嚴重的一系列醫(yī)療和社會問題.因而深入研究衰老,特別是腦衰老和其相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病,例如帕金森病、阿爾茨海默病等疾病,顯得尤為迫切.從分子、細胞和在體水平上,研究與腦衰老相關(guān)的人類重大疾病的發(fā)病機理,尋求有效的預(yù)防和治療藥物和方法,不僅可以提高老年人的生活質(zhì)量,減輕家庭和社會的負擔,更可以為人類在新的世紀中破譯腦的奧秘,最終戰(zhàn)勝腦疾病提供重要的線索和依據(jù).研究表明在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病和發(fā)展過程中,自由基損傷是一個重要因素[2-4,23-31].

2.3.1帕金森綜合癥腦組織自由基的捕集

我們實驗室利用6-OHDA誘導(dǎo)建立了帕金森綜合癥的細胞和大鼠模型,探討茶多酚對其保護作用機制.結(jié)果發(fā)現(xiàn),茶多酚可以濃度和時間依賴性減輕6-OHDA誘導(dǎo)產(chǎn)生的旋轉(zhuǎn)行為,降低中腦和紋狀體中ROS和一氧化氮自由基含量、抗氧化水平,增加了脂質(zhì)過氧化程度、硝酸鹽/亞硝酸鹽含量、蛋白結(jié)合硝基酪氨酸濃度,同時還降低nNOS和iNOS表達水平.TH免疫染色和TUNEL染色表明,茶多酚預(yù)處理可增加黑質(zhì)致密部存活神經(jīng)元,減少凋亡細胞.實驗結(jié)果證明,口服茶多酚可以有效保護腦組織免于6-OHDA損傷引起的神經(jīng)細胞死亡,其保護作用可能是通過ROS和一氧化氮自由基的途徑實現(xiàn)的[23-25].

2.3.2中風(fēng)腦組織自由基的捕集

中風(fēng)的死亡率僅次于心臟病和癌癥,列于死亡病因的第3位,同時中風(fēng)還是成年人最主要的致殘性疾病.我們建立沙鼠半腦缺血再灌注損傷中風(fēng)大鼠模型,利用ESR技術(shù)研究了中風(fēng)的自由基機制和山楂黃酮對沙鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的一氧化氮自由基調(diào)節(jié)機理,發(fā)現(xiàn)山楂黃酮對沙鼠腦缺血再灌注損傷有很好的保護作用,而且與一氧化氮自由基關(guān)系密切[26].

2.3.3老年癡呆癥腦組織自由基的捕集

我們利用Aβ誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡和轉(zhuǎn)APP基因AD小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)有大量活性氧和一氧化氮自由基產(chǎn)生,同時iNOS表達增加,與氧化應(yīng)激相關(guān)信號途徑NFB和MAPK激活.利用ESR方法,研究了轉(zhuǎn)基因鼠海馬和皮層區(qū)的NOS酶的活力和產(chǎn)生的一氧化氮自由基,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在尼古丁處理的轉(zhuǎn)基因鼠組,海馬和皮層區(qū)的NOS酶的活力顯著下降,而且在這2個腦區(qū),活性氧和一氧化氮自由基的含量也有顯著下降[27-31].

2.4輻射損傷產(chǎn)生自由基的研究

自20世紀40年代始,由于在日本廣島和長崎2顆原子彈的爆炸和大規(guī)模的核試驗,造成了大量人群的輻射損傷.很多國家都開展了這方面的研究,使放射生物學(xué)的研究有了長足的進步.用EPR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了電離輻射對機體作用會生成自由基,由此建立了機體電離輻射損傷的自由基學(xué)說,成為輻射生物學(xué)效應(yīng)的重要理論,同時也成為自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)最早被人們關(guān)注的領(lǐng)域,這對推動自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)的發(fā)展起了重要的作用[53-57].

2.4.1輻射治療和氧自由基

輻射可以致癌,但輻射也可以治療癌癥,而且是一個重要方法.這種方法就是用高能輻射照射腫瘤以殺傷腫瘤細胞,為了提高療效近年來又使用了敏化劑.用ESR技術(shù)發(fā)現(xiàn)氧自由基在放療中發(fā)揮著重要作用.輻射產(chǎn)生的羥基自由基進攻細胞靶分子(RH)常常包括抽氫和形成次級自由基(.R),如果這些次級自由基不能被氫供體很快修復(fù),就會與氧氣反應(yīng)產(chǎn)生過氧自由基(ROO.)和脂自由基(.L),這就是脂質(zhì)過氧化鏈式反應(yīng),同時還可以破壞蛋白質(zhì)和其它化合物的巰基[32-34].

2.4.2輻射敏化劑和氧自由基

輻射敏化劑是一種化學(xué)試劑,它具有增強輻射對腫瘤的殺傷作用.我們用EPR技術(shù)研究了光照血卟啉同脂質(zhì)體膜的相互作用,發(fā)現(xiàn)光照血卟啉可以使脂質(zhì)體膜通透性明顯增加,紅外激光和紫外激光增加更明顯,紫外激光比紅外激光作用更大.光照血卟啉可以使脂質(zhì)體膜中脂肪酸自旋標記物ESR信號減小,說明發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移.光照血卟啉還可以使脂質(zhì)體膜磷脂分子有序度稍有下降[32,33].光動力療法(PhotodynamicTherapy,PDT),又被稱為光輻照治療(PhotoradiationTherapy,PRT)或光化學(xué)療法(Photochemotherapy).我們建立的活性氧和一氧化氮同時捕集的方法,檢測了光照30min后細胞內(nèi)活性氧和一氧化氮的水平,光照以后可以使細胞內(nèi)活性氧和一氧化氮均顯著增加,其中活性氧增加最為明顯,說明光動力反應(yīng)產(chǎn)生的單線態(tài)氧氧化細胞內(nèi)蛋白和不飽和脂肪酸,從而顯著增加細胞內(nèi)活性氧水平[34].

2.5吸煙中產(chǎn)生的自由基中的捕集

目前我國有3.5億煙民,并且還有繼續(xù)增加的趨勢.流行病學(xué)調(diào)查表明吸煙不僅可以引起支氣管和肺損傷,而且可以導(dǎo)致人類最可怕的疾病癌癥和死亡率最高的心血管疾病.過去人們一直認為吸煙的毒性來自尼古丁,但這是錯誤的.吸煙是一個很復(fù)雜的燃燒過程,在吸煙的氣相和焦油中存在大量自由基,它們可以直接和間接攻擊細胞成分,可能是引起各種疾病的重要原因.點燃過程中產(chǎn)生的大量有害氣體,毒性最大的就是自由基,焦油和一氧化碳,其中亞硝胺和苯荓芘是焦油中致癌性最強的兩種物質(zhì).我們建立和發(fā)展了用ESR技術(shù)檢測吸煙產(chǎn)生自由基的方法.因為吸煙產(chǎn)生的自由基分布在焦油和氣相中,它們的性質(zhì)差別很大,焦油中的自由基比較穩(wěn)定,可以直接用ESR測定,氣相中的自由基活潑,不穩(wěn)定,不能用ESR直接測定,采用自旋捕集技術(shù)測定[35-38].

2.5.1吸煙焦油中的自由基

吸煙的焦油是吸煙煙氣中顆粒大于0.1μm的物質(zhì),其中包括幾種特別穩(wěn)定的自由基,可以用電子自旋共振波譜儀(ESR)直接觀察到.通過ESR波譜分析,發(fā)現(xiàn)它們主要來自醌/半醌自由基(Q./QH.),多環(huán)芳烴自由基,碳和磷自由基,后3者的濃度在焦油中比較低,只占15%,特別是最后2個就更低.每支煙焦油中自由基的濃度大約為6×1014個自由基.多環(huán)芳烴自由基是一類直接致癌物,其ESR信號不宜飽和但在室溫不宜觀察到.焦油中的主要自由基成分是Q./QH.,大約占85%,其ESR信號很容易飽和,在低溫很容易觀察,這是一類非常重要的自由基,很容易自氧化產(chǎn)生氧自由基,從而導(dǎo)致一系列毒理反應(yīng).

2.5.2吸煙氣相中的自由基

吸煙氣相中的自由基多是瞬時不穩(wěn)定自由基,不能用ESR波譜儀直接觀察,需要用自旋捕集技術(shù).我們用自旋捕集劑PBN和DMPO捕捉到了吸煙氣相的自由基,其中主要是烷氧基(RO.)和烷類(R.)自由基.這些自由基是在吸煙燃燒形成的氣流在流行過程中不斷形成的,吸煙氣相中的自由基多是瞬時不穩(wěn)定自由基,主要是一氧化氮、二氧化氮、烷氧基(RO.)和烷類(R.)自由基.這些自由基是在吸煙燃燒形成的氣流在流行過程中不斷形成的,首先含氮物質(zhì)在吸煙燃燒時氧化生成大量NO,遇氧生成反應(yīng)性更強的NO2自由基,它可以和吸煙燃燒生成的烯類物質(zhì)反應(yīng)生成烷類自由基R.,R.可以和O2反應(yīng)生成烷過氧自由基ROO.,ROO.又可以和NO反應(yīng)生成烷氧自由基RO..這些自由基遇到細胞成分就會發(fā)生反應(yīng),不僅與細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),還可以氧化蛋白質(zhì)和核酸.正是由于自由基的高反應(yīng)活性,對細胞的損傷作用,就是他引起各種疾病的重要原因.

2.6在植物抗病和感病作用研究中的應(yīng)用

動物系統(tǒng)研究表明一氧化氮自由基和活性氧在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用.最新研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮自由基作為活性氧的合作者啟動植物的保護基因和過敏壞死反應(yīng).一氧化氮自由基和活性氧在植物抗病反應(yīng)中起著極其關(guān)鍵的作用.單獨活性氧還不足以導(dǎo)致細胞死亡,一氧化氮自由基的介入和協(xié)調(diào)才可引起植物感染部位細胞的死亡,從而引起過敏壞死反應(yīng).本實驗室自2000年開始就著手利用電子自旋共振研究一氧化氮自由基在植物免疫反應(yīng)中的重要作用,取得了一些進展[39-41].

2.6.1ESR自旋捕集技術(shù)檢測植物產(chǎn)生的ROS和一氧化氮自由基捕集方法的建立在植物中檢測一氧化氮自由基與動物組織中檢測有相同之處也有不同之處,相同的是原理,不同的是方法.我們?nèi)圆捎肊SR自旋捕捉技術(shù)的原理,因為植物與動物的一個明顯區(qū)別是植物細胞有細胞壁,而動物則沒有.植物與動物另外一個不同的是其根、葉莖分離后可以在相當長時間維持正常生理狀態(tài),這為體內(nèi)檢測自由基帶來極大方便.我們建立和發(fā)展了測定植物體系產(chǎn)生一氧化氮自由基的方法,有直接方法和間接方法,有離體的也有在體的,這些方法為研究植物體系產(chǎn)生一氧化氮自由基的規(guī)律及其在植物抗感病和植物免疫反應(yīng)的機理發(fā)揮了重要作用[39,41].

2.6.2一氧化氮自由基在小麥條銹病抗感過程中的作用機理條銹菌引起的小麥銹病是世界上許多地區(qū)小麥的重要病害.利用抗病品種是防治小麥銹病的主要措施.我們利用ESR技術(shù)研究的內(nèi)源一氧化氮自由基與小麥不同抗性類型的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)一氧化氮自由基啟動的時間點和強度是決定抗病類型的關(guān)鍵因素;同時利用外源一氧化氮自由基和寡糖素對小麥抗條銹性的誘導(dǎo),證明了在小麥的過敏性壞死反應(yīng)(HR)中一氧化氮自由基與毒性病原菌信號的協(xié)同作用以及誘導(dǎo)抗性中一氧化氮自由基的時間進程與低反應(yīng)型抗性中一氧化氮自由基時間進程的一致性.通過分光光度法和蛋白印跡法分析了一氧化氮自由基的來源,并對一氧化氮自由基的多種來源進行了研究[39].

2.6.3亞硝酸還原酶是高等植物一氧化氮自由基的重要來源在動物體,一氧化氮合酶幾乎是一氧化氮自由基的唯一來源,但是在植物中一氧化氮自由基的來源就復(fù)雜的多,而且還有爭論.我們利用ESR技術(shù)研究了高等植物中一氧化氮自由基的來源,結(jié)果表明硝酸還原酶活性是在2個水平上控制的,(1)硝酸還原酶基因表達控制硝酸還原酶蛋白水平;(2)蛋白調(diào)節(jié)硝酸還原酶活性.這些結(jié)果表明小麥苗中產(chǎn)生的一氧化氮自由基主要是通過硝酸還原酶催化產(chǎn)生的,但是這并不是唯一途徑[41].

2.7ESR自旋捕集技術(shù)在抗氧化劑及藥理學(xué)研究中的應(yīng)用

中藥是中華幾千年醫(yī)藥實踐總結(jié)出來的,是我國歷史的瑰寶,對保障中華兒女身體健康發(fā)揮了重要作用.盡管很多中藥治病的機理還不清楚,但是其醫(yī)療效果是明顯有效的.在中醫(yī)藥現(xiàn)代化過程,如何研究和解釋中藥治病的機理就是一個重要內(nèi)容.我們利用ESR自旋捕集技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),很多中藥,特別是中草藥的有效成分都是天然抗氧化劑,例如五味子、黃芩、丹參等的藥理學(xué)及其有效成分對氧自由基清除作用和對細胞成分的保護作用.

2.7.1五味子藥理學(xué)作用

五味子的有效成份包括一組五味子素,主要有五味子酚(Sal),五味子醇甲(SolA),五味子甲素(SinA),五味子乙素(SinB),這些結(jié)構(gòu)不同的五味子素具有不同的藥理作用.為了探討它們藥理作用不同的根源,我們用自旋捕集技術(shù)研究了不同結(jié)構(gòu)五味子素在不同體系中對氧自由基的清除作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),結(jié)構(gòu)不同的五味子素對氧自由基的清除作用不同.五味子醇甲和五味子乙素對PMA刺激多形核白細胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的氧自由基的ESR波譜有明顯清除作用,五味子乙素對這一細胞體系產(chǎn)生的氧自由基的清除作用比五味子醇甲強,它們對氧自由基的清除能力大于維生素E,但小于維生素C[42,43].

2.7.2黃芩甙及其銅鋅絡(luò)合物藥理作用

黃芩含有豐富的黃酮類化合物.黃芩甙在臨床上主要用于抗菌消炎和抗感染.黃芩甙及其銅鋅絡(luò)合物對氧自由基的清除作用,對羥基和超氧陰離子自由基清除的速率常數(shù)和對血紅蛋白損傷的保護作用.用光照核黃素體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基,這3種物質(zhì)都不同程度清除了該體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基,其中黃芩甙銅絡(luò)合物清除能力最強,黃芩甙鋅次之,黃芩甙最弱.鋅離子對該體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基沒有影響,銅離子可使該體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化成羥基自由基.發(fā)現(xiàn)黃芩甙及其銅鋅絡(luò)合物對氧自由基引起紅細胞膜損傷有明顯的保護作用[44,45].

2.7.3在研究山楂黃酮的抗氧化和健康作用中的應(yīng)用

山楂黃酮是目前我國唯一一個取得藥字號的黃酮類藥物,我們利用電子自旋共振波譜技術(shù)檢測了山楂黃酮對自由基的清除作用,發(fā)現(xiàn)山楂黃酮對Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基有很強的清除作用,是銀杏黃酮的1.3倍,但比維生素C稍弱;對黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基有非常強的清除作用,是維生素C的大約2倍,是銀杏黃酮的大約18倍;山楂黃酮對過氧亞硝基也有很強的清除作用,是維生素C的大約1.4倍,比銀杏黃酮的弱一些.并可以清除線粒體膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的脂類自由基,這無疑是山楂黃酮具有以上藥物功能的重要基礎(chǔ)[26].

2.7.4在研究丹參酮抗氧化途徑及其對心臟病的治療作用機理中的應(yīng)用

丹參、復(fù)方丹參和丹參酮已經(jīng)廣泛用于臨床治療各種疾病,特別是心臟病,效果顯著.我們利用ESR自旋捕集技術(shù)研究了丹參酮作抗氧化劑治療心臟病和防止阿霉素毒性的機理,發(fā)現(xiàn)丹參酮對這一體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基清除率還是比較明顯的,而且有明顯的劑量依賴關(guān)系,但檢測不到丹參素和丹參酮對Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基的清除作用.發(fā)現(xiàn)丹參酮對起動脂質(zhì)過氧化的活性氧自由基的清除能力并不強,但對脂質(zhì)過氧化過程中的脂類自由基有較好的清除效果.發(fā)現(xiàn)魚藤酮,抗霉素A阻斷線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的自由基主要是羥基,用KCN阻斷線粒體也得到羥基自由基.丹參酮對心肌亞線粒體產(chǎn)生的羥基自由基的初始強度沒有什么作用,但顯著加速所測試的自由基信號的衰減[46,47].

2.8植物光合系統(tǒng)中產(chǎn)生活性自由基

高等植物葉綠體在光合作用過程本身就是一個電子轉(zhuǎn)移和容易產(chǎn)生自由基的過程,又因葉綠體在光合作用過程中處于富氧環(huán)境而極易受到氧化損傷.當光照過強或光能利用率過低時,活性氧都有可能大量產(chǎn)生.而這些活性氧對蛋白、膜脂和色素分子都具有破壞作用.因而,深入研究活性氧所誘導(dǎo)的光合作用抑制機理對于如何減緩植物細胞的強光破壞,進而提高植物的光合作用效率具有重要意義.因此很早人們就一直研究葉綠體在光合作用過程產(chǎn)生的自由基,主要是在光系統(tǒng)2(PSII)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量的超氧陰離子自由基,但是,由于捕捉劑性能的限制對超氧陰離子自由基捕獲一直不很理想,直至新一代高效自由基捕捉劑DEPMPO的出現(xiàn)之后,文獻中才報道了關(guān)于水稻葉綠體PSII顆粒中捕獲超氧陰離子自由基的可靠證據(jù)[48,49].在此基礎(chǔ)上,近年來又相繼報道了一系列有關(guān)強光照射條件下PSII顆粒內(nèi)超氧陰離子與羥基自由基的研究工作[50-54].

2.8.1PSII內(nèi)超氧陰離子自由基產(chǎn)生的ESR證據(jù)

為了更可靠地應(yīng)用自旋捕集技術(shù)確認高等植物PSII在強光(633nmHe-Ne激光器)照射下能夠生成超氧陰離子自由基,劉楊教授研究組分別采用DMPO與DEPMPO兩種自由基捕捉劑進行原位分析,實測所得的ESR信號如圖12所示.雖然從信號譜峰分析來看確信無疑2個信號都來自超氧陰離子自由基的加合物,但實驗中為避免干擾也同時驗證了SOD的岐化效應(yīng).

2.8.2PSII中由超氧陰離子、羥基自由基誘導(dǎo)的光抑制損傷產(chǎn)生自由基的自旋捕捉

高等植物長時間強光照射往往會導(dǎo)致光合器官的光合活性降低,它通常表現(xiàn)為PSII電子傳遞活性減弱和PSII反應(yīng)中心(PSII-RC)中D1蛋白的結(jié)構(gòu)損傷,這正是所謂的光抑制現(xiàn)象.雖然目前對于PSII光抑制的分子機制尚不十分明確,已經(jīng)提出的光抑制模型主要有受體側(cè)光抑制[55,56]、給體側(cè)光抑制[57-60]、單線態(tài)氧假說[60,61]和錳依賴的光抑制[56].此外,文獻[57]認為光合器官不僅僅只在吸收了過量光能的時候才會發(fā)生光抑制現(xiàn)象,在弱光條件同樣會產(chǎn)生光抑制.為更準確地評價光誘導(dǎo)產(chǎn)生的超氧陰離子對PSII放氧活性的影響,在放氧活性檢測的平行條件下進行自旋捕集實驗.他們在捕獲劑DEPMPO存在的條件下,在PSII顆粒樣品中得到了與在次黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶(HX/XOD)體系捕獲的DEPMPO超氧加合物(DEPMPO-OOH)(圖13(b))一致的ESR信號(圖13(a)).其精細裂分常數(shù)為AN=1.32mT、AH=1.10mT、AP=5.01mT,與文獻報道的DEPMPO-OOH精細裂分常數(shù)(AN=1.34mT、AH=1.19mT、AP=5.25mT)相符[53].該結(jié)果再次驗證了PSII顆粒在光照條件下的確可以產(chǎn)生超氧陰離子.圖13(c)給出的是PSII內(nèi)源SOD活性被抑制時的ESR信號,PSII經(jīng)TCNE處理后,其內(nèi)的細胞色素b559由高氧化還原電位態(tài)轉(zhuǎn)變成低氧化還原電位態(tài),從而使PSII喪失了內(nèi)源SOD活性,于是所檢測到的自由基信號大大增強.對比而言,外源SOD的加入幾乎完全清除了PSII在光照條件下產(chǎn)生的超氧陰離子,ESR基本檢測不到DEPMPO-OOH信號(圖13(d)).此處自由基ESR信號的消失與外源SOD使光抑制處理的PSII的放氧活性恢復(fù)到非光抑制處理空白水平的96%相呼應(yīng).

2.8.3過氧化氫和羥基自由基對PSII放氧活性的抑制作用

與過氧化氫相比,羥基自由基是一種更加活躍和更具有破壞性的活性氧物種,在強光引起的光抑制中最有可能破壞PSII的放氧中心,致使PSII失活.因此在光抑制過程產(chǎn)生的過氧化氫對放氧的破壞作用不但源于過氧化氫本身,而且更可能源于它的衍生物--羥基自由基.為直接驗證由過氧化氫介導(dǎo)的羥基自由基的產(chǎn)生,實驗中以DEPPEPO為自由基捕捉劑檢測PSII光抑制過程中產(chǎn)生的自由基信號.在此需要說明的是,DEP-PEPO是親脂性的DEPMPO的類似物,同DEPMPO一樣也能夠有效地捕獲超氧陰離子和羥基自由基[54].由于DEPPEPO在1-辛醇/水體系中的油水分配系數(shù)(Kp)值為7.6,所以它可優(yōu)先選擇性地進入到PSII顆粒的脂溶性區(qū)域,并有效地原位捕獲該地區(qū)產(chǎn)生的自由基[44,45].如圖14(a)所示,在光抑制處理PSII中并未檢測到DEPPEPO羥基自由基加合物(DEPPEPO-OH)的ESR信號,但將PSII與5mmol/LH2O2在冰浴中共育10min后實驗觀察到了DEPPEPO-OOH和DEPPEPO-OH兩組分別來自超氧陰離子和羥基自由基加合物的疊加ESR譜(圖14(b)).通過對圖14(b)的計算機模擬譜(圖14(c))進一步求得它們的精細裂分常數(shù)(DEPPEPO-OOH:AN=1.28mT、AH=1.25mT、AP=5.28mT;DEPPEPO-OH:AN=1.39mT、AH=1.36mT、AP=4.95mT).外源過氧化氫可能通過Fenton類型的反應(yīng)產(chǎn)生更多的羥基自由基,PSII中結(jié)合的金屬離子,包括亞鐵血紅素和非亞鐵血紅素的鐵和錳都可能是催化該反應(yīng)的活性位點[62].另外,在水溶液中羥基自由基的平均壽命只有0.1μs,相應(yīng)的平均擴散距離也只有4.5nm.由此可見羥基自由基在如PSII顆粒等非水環(huán)境中的平均擴散距離將更小.所以,羥基自由基在其產(chǎn)生位點很小的范圍內(nèi)就與細胞成分發(fā)生反應(yīng).由此認為由DEPPEPO捕獲的羥基自由基很可能產(chǎn)生于PSII顆粒放氧中心附近的脂溶性區(qū)域,從而更容易損傷PSII的放氧中心,使其放氧活性降低.

2.8.4去錳過程中PSII對超氧陰離子的調(diào)節(jié)

PSII具有光誘導(dǎo)生成超氧陰離子的性質(zhì),并且TCNE可以增加上述過程中的自由基.此外,還發(fā)現(xiàn)經(jīng)抑制劑TEMED處理得到的去錳PSII對Cytc光還原較未處理空白水平更高,說明去錳處理使得PSII內(nèi)的超氧陰離子自由基濃度增加.他們推測PSII中的錳加33k蛋白以及HPCytb559都可能具有內(nèi)源SOD的活性.近期Zhang等人[63]針對PSII去錳體系用ESR自旋捕集方法驗證了光誘導(dǎo)超氧產(chǎn)生的增加效果.他們的解釋是:PSII中的內(nèi)源SOD活性是由33k蛋白和錳共同擔當.根據(jù)上述結(jié)果推測PSII中去錳過程、Cytb559的HP或LY狀態(tài)與超氧陰離子自由基之間可能存在一個內(nèi)在的關(guān)聯(lián).首先,圖15中的(a)與(b)分別展示出PSII在去錳前后的用新型磷?；杂苫东@劑DEPMPO所得的超氧陰離子自由基信號變化.在捕捉劑DEPMPO存在條件下光照所得的DEPMPO超氧加合物[DEPMPO-OOH]•的ESR信號可以根據(jù)2點加以確認:其一是比較自由基加合物信號(圖15(a)與圖15(b))與經(jīng)典XOD/HX體系(圖15(c))的ESR波譜圖形,實驗發(fā)現(xiàn)二者幾乎完全一致;再者根據(jù)圖15(a)所測超精細耦合參數(shù)(AN=1.32mT、AH=1.10mTandAP=5.01mT)也與以往文獻報道超氧陰離子加合物參數(shù)十分接近.為檢驗PSII內(nèi)在產(chǎn)生超氧陰離子自由基實際能力,在圖15(d)實驗中加入內(nèi)源SOD活性的抑制劑-TCNE,發(fā)現(xiàn)ESR信號強度陡然大幅度增加.在TCNE不存在條件下,MD-PSII超氧陰離子的生成量較UT-PSII的自由基生成量強了約1.2倍.然而,當加入TCNE,MD-PSII的實驗結(jié)果顯示其超氧陰離子的ESR信號較TCNE處理前僅增強一倍左右;相比之下,UT-PSII的超氧陰離子生成量在添加TCNE后增加了一個數(shù)量級以上.換言之,加TCNE后MD-PSII超氧陰離子的生成量僅為UT-PSII的自由基生成量的1/6,二者信號強度的次序完全顛倒.以上僅為應(yīng)用自旋捕集-ESR方法對高等植物PSII內(nèi)以超氧陰離子自由基為代表的活性自由基進行研究的一些實例,并且通過結(jié)合其它實驗與理論研究手段獲得了一系列光合作用研究中有關(guān)活性氧光抑制與光保護問題的新成果.這些有關(guān)光系統(tǒng)中活性自由基的研究實例還充分說明自旋捕集-ESR技術(shù)是一種研究生物自由基的最可靠的手段.

2.9蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生自由基的捕集

因為在細胞中含有豐富的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)與自由基的高反應(yīng)性,蛋白質(zhì)就成為細胞內(nèi)氧化損傷的主要靶分子.蛋白質(zhì)與自由基反應(yīng)能形成不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)自由基,這些蛋白質(zhì)自由基又能與氧氣反應(yīng)生成新的氫過氧化物自由基,并且在蛋白質(zhì)內(nèi)部啟動鏈式反應(yīng),導(dǎo)致DNA斷裂.這些氧化損傷可以發(fā)生在蛋白質(zhì)的側(cè)鏈也可以發(fā)生在主骨架上.一些氧化劑對蛋白質(zhì)的氧化局限在一些特殊的殘基上,而另外一些氧化劑,如羥基自由基是非特異的,對蛋白質(zhì)的氧化是廣泛的.因此利用ESR自旋捕集技術(shù)就可以研究這些蛋白質(zhì)氧化的自由基機理.

2.9.1對蛋白質(zhì)骨架的氧化損傷產(chǎn)生的自由基

Davies等人研究發(fā)現(xiàn)自由基同蛋白質(zhì)骨架快速反應(yīng)出現(xiàn)在從一個碳位置的抽氫反應(yīng)上,形成一個穩(wěn)定的碳中心自由基.這個碳中心自由基有2個可能的反應(yīng),一是與另外一個自由基和氧氣反應(yīng)而停止氧化過程,這主要是由于在生物體系中和空間電子相互作用造成的.主要通路通過釋放HO-2和產(chǎn)生一個亞胺而結(jié)束自由基反應(yīng),接著就是蛋白質(zhì)水解和骨架斷裂.二是從另外一種物質(zhì)抽氫產(chǎn)生過氧化氫,接著分解形成烷氧自由基再引起骨架的斷裂和產(chǎn)生亞胺[64].

2.9.2特異蛋白質(zhì)氧化損傷-側(cè)鏈氧化損傷產(chǎn)生的自由基

大部分蛋白質(zhì)的脂肪酸側(cè)鏈只同反應(yīng)性很強的自由基反應(yīng).一個最值得注意的是次鹵酸(HOCl,HOBr)與賴氨酸和精氨酸發(fā)生的二電子鹵素轉(zhuǎn)移反應(yīng),產(chǎn)生不穩(wěn)定的氯胺/氯酰胺和溴胺/溴酰胺,接著分解產(chǎn)生氮中心和炭中心自由基[65].這些自由基主要引起抽氫反應(yīng)產(chǎn)生炭中心自由基.同羥基反應(yīng)可能出現(xiàn)在任何位置和可以產(chǎn)生一系列自由基,隨自由基的不同,產(chǎn)生自由基也不同,利用ESR自旋捕集技術(shù)可以檢測到不同自由基[66].產(chǎn)生的炭中心自由基有2種可能的反應(yīng),一是與另外一個自由基反應(yīng)形成二聚體,在有氧氣存在時不太會發(fā)生這類反應(yīng),而在缺氧情況下發(fā)現(xiàn)會在蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián),進一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集;二是這個碳中心自由基會被巰基修復(fù)產(chǎn)生含硫自由基[67].在蛋白質(zhì)上形成的過氧自由基可以發(fā)生自由基-自由基終結(jié)反應(yīng),產(chǎn)生醇類和羰基類化合物或者烷氧自由基和氧氣.烷氧自由基一旦形成就會發(fā)生快速抽氫反應(yīng),進一步產(chǎn)生醇類和羰基類化合物[68].這類反應(yīng)產(chǎn)生的自由基在生物體系就會進攻其它生物分子,如DNA[69],脂類和其它蛋白質(zhì)[70].芳香側(cè)鏈的氧化反應(yīng)大部分發(fā)生在加成反應(yīng)中[71],酪氨酸殘基與自由基反應(yīng)產(chǎn)生酪氨酸苯氧自由基,這個反應(yīng)或者通過芳香環(huán)的直接氧化或者通過在羥基物質(zhì)脫氫.或者通過加成反應(yīng)完成.這個自由基可以通過自我反應(yīng)形成二聚體或者交聯(lián)反應(yīng)形成二酪氨酸[72].這會發(fā)生在分子內(nèi)和分子間的蛋白質(zhì)交聯(lián).這些苯氧自由基可以同氫供體,巰基,多酚類物質(zhì)和維生素C等反應(yīng)修復(fù)氨基酸損傷[73].

2.9.3乳蛋白的氧化產(chǎn)生的自由基

Mason實驗室發(fā)展了利用ESR-HPLC聯(lián)用技術(shù)檢測蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生的自由基[74].利用DMPO多克隆抗血清能夠特異靈敏辨認蛋白質(zhì)與DMPO產(chǎn)生的加合物的性質(zhì),他們研究了乳過氧化物酶(LPO)產(chǎn)生的自由基(圖16).在DMPO存在時,LPO與GSH反應(yīng)生成LPO自由基DMPO加合物,這個加合物的產(chǎn)生與GSH、LPO和DMPO及pH值有關(guān),GSH不能用H2O2取代.加入疊氮鈉、過氧化氫酶、維生素C、硫氰酸、I-、亞硝酸鹽,多酚加合物明顯減少.在LPO/GSH/DMPO體系中ESR自旋捕捉到一個GSH自由基信號,但是沒有直接檢測到蛋白質(zhì)自由基的信號.加入疊氮鈉、過氧化氫酶、維生素C、I-、硫氰酸明顯減少這一信號,而多酚和亞硝酸鹽卻增加這一信號.GSH能明顯改變LPO化合物II的波譜特征,表明GSH結(jié)合到化合物II的血紅素上,而多酚和亞硝酸鹽能夠抑制這一改變把化合物II還原到天然酶,GSH還能抑制LPO的氧化活性.因此,這些結(jié)果表明這個自由基可能是通過硫氫基與化合物IId血紅素反應(yīng)形成的以血紅素為中心的自由基被DMPO捕捉到的.

2.9.4糖胺聚糖氧化產(chǎn)生的自由基

過氧亞硝基/過氧亞硝酸(ONOO/ONOOH)是強氧化劑,在炎癥過程可以大量產(chǎn)生,氧化損傷細胞成分.Davies等人[75]研究了ONOO/ONOOH與糖胺聚糖產(chǎn)生的產(chǎn)物.ONOO/ONOOH可以修飾透明質(zhì)酸,肝素,軟骨素,皮膚素和硫酸類肝素,但都依賴氧氣.這個反應(yīng)通過裂解二糖產(chǎn)生一些特異的多聚物片段.EPR自旋捕集實驗表明在糖胺聚糖和有關(guān)單糖上形成了炭中心自由基(如圖17).這些結(jié)果表明在炎癥過程中,在細胞外可能形成了ONOOH和有關(guān)自由基.

3ESR自旋捕集技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的發(fā)展趨勢

通過以上討論我們可以看出,近年來國際和國內(nèi)ESR自旋捕集技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中獲得了迅速發(fā)展并在生物學(xué)和一些重大疾病如心臟病,神經(jīng)退行性疾病,老年癡呆癥,帕金森綜合癥和中風(fēng)等疾病研究中獲得了廣泛的應(yīng)用.ESR自旋捕集技術(shù)需要進一步發(fā)展,合成更多捕集效率高,形成自旋加合物更穩(wěn)定,能夠定位在生物體和細胞特定位置.另外,在生物醫(yī)學(xué)研究中,特別是臨床中的應(yīng)用,與熒光標記技術(shù)相比其靈敏度和分辨率都有改進的余地,還存在很多發(fā)展的空間.這對ESR自旋捕集技術(shù)既是挑戰(zhàn)又是機遇.