生物醫(yī)學動物實驗研究
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1實驗設計
在開展生物醫(yī)學研究時，研究者通過正確地運用統(tǒng)計學知識，可直接影響研究的質(zhì)量。統(tǒng)計學設計的任務在于對研究的部署、實施，直到研究結果的解釋進行系統(tǒng)的安排，力爭做到以最少的人力、物力獲得可靠的結論和信息。其目的在于確定某種處理是否會表現(xiàn)出某種特定的效應。在實驗設計時應遵循惟一差異原則，即在進行兩組比較時，兩者之間僅有因處理因素不同而引起的差異，而其他實驗條件相關的非處理因素都應保持等同。然而，處理組與對照組在反應上表現(xiàn)出的差別并不一定意味著是處理的結果。另有兩種引起差別的可能性，即偏倚和偶然性。偏倚是指系統(tǒng)性差別，它不是因組間在處理上的不同所引起。生物醫(yī)學實驗中統(tǒng)計學設計和分析的目標就是消除潛在的偏倚，減少偶然性[2]。
1.1實驗的偏倚和控制
偏倚是在研究中從設計到實驗實施和結果分析的各環(huán)節(jié)存在一些人為的、有系統(tǒng)傾向的非隨機誤差，它不是由于抽樣造成的，而是某種偏性使得實驗結果偏離它的真值。從所選擇的生物醫(yī)學問題到研究方案的制訂與實施、實驗的完成過程、實驗的分析與解釋，乃至實驗結果的發(fā)表，均可能存在各式各樣的偏倚[2]。這種偏倚常常表現(xiàn)為系統(tǒng)誤差。偏倚的大小取決于研究的方法和具體的實驗條件。常見的偏倚主要有選擇性偏倚、觀察性偏倚和混雜性偏倚。必須認識實驗過程的偏倚，從實驗設計起直到整個研究過程結束均要加以控制。正確的實驗設計可控制選擇性的偏倚，事前人為控制和采取相應的措施可避免和減少觀察性的偏倚。對于混雜性偏倚，可將重要的混雜因素在設計階段進行分層隨機設計，使混雜因素在組間分布均衡；在統(tǒng)計分析階段將混雜因素作為分層因素或采用有協(xié)變量分析方法，以消除混雜因素的影響。只有有效地控制或消除偏倚，方可減少結果的假陽性或假陰性。
1.2減少偶然性的潛在影響
偶然性因素的作用可以減少，但不能完全排除。因為即使是在精心實施的研究中，接受同樣處理的動物，其反應也不可能完全一樣。適當?shù)慕y(tǒng)計分析可使實驗人員評估出現(xiàn)假陽性的概率，即根本不存在處理效應的情況下觀察到差異的概率。這種概率越小，實驗者發(fā)現(xiàn)真實效應的可能性就越大。為了更有把握地檢測出真實效應，有必要減少偶然性的作用，并通過實驗設計確保能在“噪聲”之上識別真正的“信號”。
1.3實驗設計的要素
要消除生物醫(yī)學實驗中潛在的偏倚，減少偶然性，就應對實驗對象、處理因素和實驗效應這三個實驗設計要素，按照對照、重復、隨機化和均衡四項原則進行周到的設計與控制[3]。1.3.1實驗對象實驗中處理因素所作用的對象稱為實驗對象。不同性質(zhì)的實驗研究需要選取不同種類的實驗對象，一個完整的實驗設計中所需實驗對象的總數(shù)稱為樣本含量。生物醫(yī)學試驗中考慮動物實驗對象時應關注以下幾個方面：①動物種屬的選擇：選擇實驗動物的種屬與品系時，尤其需要注意其背景反應的水平。為了將反應“信號”水平最大化，常常意味著應避免選擇那些背景反應水平極低的動物種屬或品系，但如果采用過度反應的動物種屬或品系也同樣會出現(xiàn)問題。動物物種選擇中的其他問題，無論是實際問題（壽命、體型、易得性、對動物學特征的了解情況）或是理論問題（生化、生理或解剖結構與人的相似性），都需要從專業(yè)的角度認真加以考慮和權衡。②動物的數(shù)量：雖然從統(tǒng)計設計角度考慮可得出某項實驗所需的動物數(shù)（樣本含量），但所得出的數(shù)值往往很大。因此，雖然樣本含量估計是保證結論可靠性（精度和檢驗效能）的前提，但基于實驗的可操作性及經(jīng)濟原則方面的考慮，應結合統(tǒng)計學的計算結果與以往的生物醫(yī)學研究經(jīng)驗予以確定。③動物的體重與年齡：為確保實驗對象的同質(zhì)性，實驗中所使用的動物體重與年齡應盡可能相近；動物體重的標準差不應超出平均值的10%；嚙齒類等小動物年齡相差不應超出1周，大動物年齡相差不應超出1個月。④動物的分層：為了準確檢測一種處理因素引起的差別，各處理組在可能影響實驗結果的其他非處理因素方面應盡可能具有同質(zhì)性。當存在動物亞系間的差別時，有兩種方法可得到更為準確的結論。一是在結果分析階段將亞系作為一個“分層變量”處理，包括對兩個亞系的結果進行單獨分析，然后將結果綜合，得出處理效應的總結論；二是將亞系作為實驗設計的“區(qū)組因素”，這種情況下可使對照組與處理組中每個亞系動物數(shù)量相等。除以上所討論的“亞系”之外，其他的非處理因素，如性別、窩別、體重段等也可作為分層變量進行局部控制，并據(jù)此進行分層隨機化分組。1.3.2處理因素設計實驗研究時，要明確研究中的處理因素和影響實驗效應的非處理因素。研究者希望通過對研究設計進行有計劃的安排，從而能科學地考察其效應大小的因素稱為處理因素或?qū)嶒炓蛩兀谎芯空咄雎詫υu價實驗因素作用大小有一定干擾的重要的非處理因素或非實驗因素（如動物的窩別、體重等）；其他未加控制的許多因素的綜合作用統(tǒng)稱為實驗誤差。實驗結果是處理因素和非處理因素共同作用而產(chǎn)生的實驗效應，因此如何控制和排除非處理因素的干擾，正確顯示處理的效應，是實驗設計的基本任務。1.3.3實驗效應實驗效應是處理因素作用于受試對象的反應和結果，是反映實驗因素作用強弱的標志，它通過觀察指標（統(tǒng)計學常將指標稱為變量）來體現(xiàn)。如果指標選擇不當，未能準確反映處理因素的作用，獲得的研究結果就缺乏科學性，因此選擇好觀察指標是關系整個研究成敗的重要環(huán)節(jié)。指標的觀察應避免帶有偏性或偏倚，要結合專業(yè)知識，盡可能多地選用客觀性強的指標，在儀器和試劑允許的條件下，應盡可能多選用特異性強、靈敏度高、準確可靠的客觀指標。對一些半客觀（如尿液pH試紙讀數(shù)值）或主觀指標（行為測量、病理觀察），一定要事先規(guī)定讀取數(shù)值的嚴格標準，只有這樣才能準確地分析實驗結果，從而提高實驗結果的可信度。
1.4實驗設計的原則
為了防止結果的偏倚，保證實驗結果的準確性和最大化的表達，在進行生物醫(yī)學實驗設計時必須遵循統(tǒng)計學設計的對照、重復、隨機化和均衡四個基本原則。生物醫(yī)學實驗中對照組的設置必須具備三個條件：①對等原則，即惟一差別原則，除處理因素外，對照組具備與實驗組對等的非處理因素。在相互比較的各組間，除了給予的處理因素不同外，其他方面應與實驗組具有一致性，如相同的實驗單位來源（動物種屬、體重等）和相同的實驗條件、操作方式和喂養(yǎng)環(huán)境等。②同步原則，對照組與實驗組設立之后，在整個研究進程中始終處于同一空間和同一時間。③專設原則，任何一個對照組都是為相應的實驗組專門設立的。不得借用文獻上的記載或以往結果或其他研究資料作為本研究之對照。
1.5生物醫(yī)學中常用的實驗設計類型
如果需要在同一實驗中同時評價幾種不同的效應，實驗者應該安排能區(qū)別各自效應差別的實驗設計方法。生物醫(yī)學中常用的實驗設計有以下幾項。1.5.1完全隨機設計完全隨機設計是生物醫(yī)學動物實驗中最為常用的一種實驗設計方法，它是一種單因素有k個水平（k≥2）組的實驗設計。即實驗設計可設置一個對照或多個劑量組的實驗方案。本設計保證每個實驗動物都有相同機會接受任何一種處理，而不受實驗人員主觀傾向的影響。本設計應用了重復和隨機化兩個原則，因此能使實驗結果受非處理因素的影響基本一致，真實反映出實驗的處理效應。1.5.2隨機區(qū)組設計隨機化完全區(qū)組設計，簡稱隨機區(qū)組設計，又稱配伍組設計，是配對設計的擴展，它將幾個條件相同的受試者劃分在同一個區(qū)組或配伍組，然后再按隨機的原則，將同一配伍組的受試者隨機分配到各實驗組。該設計方法的優(yōu)點是每個區(qū)組內(nèi)的k個實驗單位有較好的同質(zhì)性，比完全隨機設計更容易察覺處理間的差別。這種方法須特別注意的是要求區(qū)組內(nèi)實驗單位數(shù)與處理數(shù)相同，實驗結果中若有缺失值，統(tǒng)計分析將損失部分信息。1.5.3拉丁方設計拉丁方設計從橫行和直列兩個方向進行雙重局部控制，使得橫行和直列兩向皆成區(qū)組，是比隨機區(qū)組設計多一個區(qū)組因素的設計。在拉丁方設計中，每一行或每一列都成為一個完全區(qū)組，而每一處理在每一行或每一列都只出現(xiàn)一次，也就是說，在拉丁方設計中，實驗處理數(shù)=橫行區(qū)組數(shù)=直列區(qū)組數(shù)=實驗處理的重復數(shù)。1.5.4析因設計析因?qū)嶒炘O計又稱全因子實驗設計，屬于多因素、多水平單效應的設計。它不僅可以檢驗每一因素各水平之間的效應差異，而且可以檢驗各因素之間的交互作用。交互作用是指一個因素不同水平間的效應差受另一因素的影響，包括協(xié)同交互作用和拮抗交互作用。析因?qū)嶒炛饕糜诜治鼋换プ饔?，當因素及水平?shù)過多時，所需的實驗對象數(shù)、處理組數(shù)和實驗次數(shù)大幅度增加，故一般采用較簡單的析因?qū)嶒?。含有較多因素和水平的實驗一般采用正交實驗設計[5]。
2生物醫(yī)學動物實驗的描述統(tǒng)計學
2.1生物醫(yī)學實驗資料的類型
生物醫(yī)學實驗對實驗對象（動物）進行干預后測定的觀測指標通常有以下類型：①連續(xù)性數(shù)據(jù)：測定結果表現(xiàn)為有數(shù)字大小和單位的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計上稱定量資料，如生理、生化指標，體重值，器官重量等。②分類數(shù)據(jù)：測定結果表現(xiàn)為按某屬性劃分的定性類別，統(tǒng)計上稱為定性資料，具體又可以分為二值資料、多值名義資料和多值有序資料。如某反應為出現(xiàn)或不出現(xiàn)，死亡或未死亡，有畸形或無畸形；病理損害的嚴重程度（無、輕度、中度、重度）等。
2.2統(tǒng)計描述指標
描述性統(tǒng)計學（或歸納統(tǒng)計學）是對樣本觀察/測量數(shù)據(jù)頻率分布的定量研究，描述性統(tǒng)計的目的在于：①對測量值或觀察值進行歸納濃縮，用統(tǒng)計量、統(tǒng)計圖或統(tǒng)計表的形式表現(xiàn)；②估計總體分布的參數(shù)。2.2.1資料的整理與探索對于某一測量指標，一般應從文獻資料中了解其分布類型。如果沒有判斷概率分布的理論基礎，應重復以大樣本測定，繪制樣本的頻數(shù)分布圖（理論上樣本量要大于100），并經(jīng)統(tǒng)計學檢驗擬合其分布。2.2.2數(shù)據(jù)的描述統(tǒng)計量①連續(xù)性數(shù)據(jù)的頻數(shù)分布：通過對樣本資料編制頻數(shù)分布表或做莖葉圖，以確定資料分布的類型、頻數(shù)分布的集中趨勢和離散趨勢、估計總體參數(shù)，也便于發(fā)現(xiàn)離群值。②中心位置的描述統(tǒng)計量：描述數(shù)據(jù)分布的集中趨勢，常用指標為算術均數(shù)、中位數(shù)、眾數(shù)、幾何均數(shù)等。③離散程度的描述統(tǒng)計量：描述數(shù)據(jù)分布的離散趨勢，常用指標為標準差和方差、極差和四分位數(shù)間距、變異系數(shù)和離散系數(shù)等。④統(tǒng)計學圖表：統(tǒng)計圖包括連續(xù)性數(shù)據(jù)分布的直方圖、莖葉圖，表示數(shù)據(jù)中心位置和離散程度的點桿圖（做圖時表示均數(shù)和標準差）和盒須圖（做圖時表示中位數(shù)、極差、四分位數(shù)間距），描述構成比數(shù)據(jù)資料的百分條圖、餅圖，描述經(jīng)時變化趨勢的線圖，以及預測和檢驗分布類型的概率-概率圖（P-P圖）等[6]。統(tǒng)計表具有簡單、明了、易于理解、便于比較的優(yōu)點。編制統(tǒng)計表時原則上應當重點突出、層次分明、避免層次過多或結構混亂。一般的統(tǒng)計表應為三線表，表中只有橫線，無豎線和斜線。統(tǒng)計表的標目應層次清楚，不宜過于復雜。
3生物醫(yī)學動物實驗的假設檢驗
生物醫(yī)學動物實驗中最常見的情況是給予不同受試物后進行組間比較，通過統(tǒng)計學中的假設檢驗，說明受試物的作用。假設檢驗時應注意以下問題。
3.1檢驗方法的選用依據(jù)
3.1.1資料的類型和變量的數(shù)目不同類型的資料（定量、定性）的組間比較應采用不同的統(tǒng)計檢驗方法。單變量、多變量的統(tǒng)計檢驗方法也各不相同。3.1.2實驗設計類型應該根據(jù)實驗設計的具體類型選擇對應的統(tǒng)計檢驗方法，以便得到處理組效應的真實結論。3.1.3檢驗方法的前提條件選用假設檢驗方法前，應了解所分析的數(shù)據(jù)資料是否滿足相應檢驗方法的前提條件，如t檢驗和方差分析等參數(shù)檢驗方法要求數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性和方差齊性，χ2檢驗要求樣本含量大于40且理論頻數(shù)大于5。
3.2正態(tài)性檢驗及擬合優(yōu)度檢驗
統(tǒng)計學假設檢驗須判定樣本的頻數(shù)分布是否符合某一理論分布，如符合要求就可按此理論分布來進行統(tǒng)計學處理。對正態(tài)分布可采用正態(tài)性檢驗，其他分布可用擬合優(yōu)度檢驗。通?？赏ㄟ^查閱文獻，了解實驗參數(shù)符合何種理論分布。
3.3方差齊性檢驗
連續(xù)性數(shù)據(jù)未達到參數(shù)法統(tǒng)計分析前提的第二種原因即為方差不齊。一般而言，數(shù)值愈大，其固有的變異性也愈大。例如，若某組動物的平均反應值為100，其數(shù)值范圍可能為80~120；而另一組動物的平均反應值為300，其數(shù)值范圍可能會擴大至240~360。解決方差不齊的措施是進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。若數(shù)據(jù)的標準差與平均值成正比，在統(tǒng)計分析前宜將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為對數(shù)值之后再進行分析，據(jù)此，不僅數(shù)據(jù)的變異度與平均值大小無關，同時還可確保其更符合正態(tài)分布。若數(shù)據(jù)變異度增加幅度與平均值的關系不太明顯，采用平方根轉(zhuǎn)換則更易使數(shù)據(jù)的變異度與平均值大小無關。某些數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)或平方根轉(zhuǎn)換后可能仍存在方差不齊，此時宜采用非參數(shù)檢驗。
3.4單側檢驗與雙側檢驗
檢驗假設選擇單側檢驗或雙側檢驗，應事先根據(jù)專業(yè)知識做出選擇。一般而言，若研究目的僅須了解是否存在組間差異、實驗者無法預測組間變化的方向以及實驗者希望獲得正負兩方面的結果時，應采用雙側檢驗。若事先可預測組間差異的變化方向，實驗者僅對某一方面的重要性感興趣，實驗者僅希望了解與對照組差異或正或負一個方向，則應采用單側檢驗。此外，劑量設計預試驗中應采用雙側檢驗，正式試驗在了解相關信息后可采用單側檢驗。
3.5多重比較及多重性問題
生物醫(yī)學實驗經(jīng)常在處理組和對照組之間做多個變量的比較。即使不存在真正的實驗效應，也有可能純粹由于偶然性而有一個或多個變量在5%檢驗水平出現(xiàn)顯著性差別。除了上述均數(shù)多重比較導致Ⅰ類錯誤概率增加的多重性問題之外，其他的多重性問題還包括多次的中期分析、關注多個結局、亞組間的多重比較。處理多重性問題的原則包括：①預先計劃進行多重比較；②限制比較的次數(shù)；③多重比較時采用更嚴格的界值標準；④多重比較具有生物學方面的依據(jù)。
3.6觀察值或?qū)嶒瀸ο蟮莫毩⑿?/p>
許多統(tǒng)計檢驗方法要求比較的觀察值或?qū)嶒瀸ο笙嗷オ毩?，如二項分布的率檢驗、t檢驗和方差分析等。但是，有的生物醫(yī)學實驗中觀察單位并不獨立。例如，生殖和發(fā)育研究中就存在窩效應：由于遺傳因素、宮內(nèi)的發(fā)育環(huán)境和藥物的代謝環(huán)境相似，與異窩胎仔相比，同窩胎仔之間對毒性效應的反應概率趨于系統(tǒng)，即同窩內(nèi)數(shù)據(jù)為聚集性數(shù)據(jù)，這就是一種常見的非獨立數(shù)據(jù)。在統(tǒng)計學分析時，忽略數(shù)據(jù)的窩內(nèi)相關性具有潛在的風險；因同窩母鼠所產(chǎn)k個胎仔的觀察值存在共性，其所提供的信息不及k個獨立的來自不同母鼠所產(chǎn)胎仔所提供的信息；窩內(nèi)相關性愈大，其信息量愈少。聚集性數(shù)據(jù)的均數(shù)標準誤小于獨立的數(shù)據(jù)，因此，若基于觀察值獨立的統(tǒng)計分析方法，就會增加犯Ⅰ類錯誤的概率，即假陽性的風險增加，降低實驗的有效性。
3.7歷史對照數(shù)據(jù)的應用
某些情況下，尤其是在發(fā)生率較低的情況下，單項研究可能提示處理可影響腫瘤發(fā)生率，但無法得出明確的結論?？赡芟氲降姆治鲛k法之一是將處理組的數(shù)據(jù)與來自其他研究的對照組動物相比較。雖然歷史對照數(shù)據(jù)具有重要意義，但值得強調(diào)的是，眾多原因可導致不同研究之間的變異度大于研究之內(nèi)的變異度。動物來源、飼料及飼養(yǎng)條件，研究期限，研究中的動物死亡率、讀片的病理學家等均可能影響最終的腫瘤發(fā)生率。故此，忽視這些差異，將處理組的腫瘤發(fā)生率與合并的對照組發(fā)生率相比較，可能得出嚴重錯誤的結果，并進而明顯夸大統(tǒng)計顯著性水平。Tarone[4]曾對歷史對照組的比率數(shù)據(jù)分析進行過綜述。
3.8假設檢驗的局限性
首先，假設檢驗中的P值并未提供有關處理誘發(fā)效應大小的直接信息。某一受試物可誘發(fā)一定量的、反應的增加，但增加的幅度是否具有統(tǒng)計顯著性則取決于研究的規(guī)模和數(shù)據(jù)的變異性。在規(guī)模較小的研究中，有可能錯失較大、重要的效應，尤其是在檢測終點測量精度不高的情況下。相反，在規(guī)模較大的研究中，較小、非重要的效應則具有統(tǒng)計顯著性。例如，D藥與C藥相比，降血壓效應相差近30mmHg，但因為例數(shù)僅10例，假設檢驗未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P=0.31）；相反，B藥與A藥相比，降血壓效應僅相差0.2mmHg，但因為例數(shù)達500例，假設檢驗卻發(fā)現(xiàn)存在顯著性差異（P<0.001）。由此可見，統(tǒng)計學顯著性與效應大小無直接相關性。因此，愈來愈多的統(tǒng)計學家主張以處理組與對照組差異值的95%置信區(qū)間表述處理的效應。據(jù)此，若處理反應的增加值為10個單位（95%置信區(qū)間3~17單位），則該區(qū)間包含真實差異的幾率為95%。若置信區(qū)間的下限大于零，則雙側檢驗的P值小于0.05。其次，假設檢驗無法消除實驗設計或?qū)嵤┎划斔鶐淼挠绊?。雖然前述的分層分析等有助于發(fā)現(xiàn)真實的差異，但若實驗設計存在偏倚，或?qū)嶒瀸嵤┻^程中存在偏差或失誤，假設檢驗方法一般也于事無補。因此，在生物醫(yī)學實驗過程中應注重對實驗設計或?qū)嵤┻^程進行嚴格的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證措施，強化GLP規(guī)范意識。其三，對統(tǒng)計學分析本身的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證也是確保研究質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。所用統(tǒng)計分析軟件包應經(jīng)過充分的認證，以確保分析結果的準確、可靠性。數(shù)據(jù)的錄入、核對和分析結果的報告與歸檔，均應制訂并嚴格執(zhí)行相關的標準操作規(guī)程。綜上所述，在動物實驗研究的多個環(huán)節(jié)，統(tǒng)計學中的相關理論和方法都能夠發(fā)揮重要作用。統(tǒng)計學不僅可以保證結果的科學性和可靠性，在很多情況下也可以極大地提高研究效率，節(jié)約研究成本。在這里還必須強調(diào)，除了實驗后期的數(shù)據(jù)分析以外，在實驗方案的制定階段也需要統(tǒng)計學人員的早期介入，這樣有助于避免實驗設計出現(xiàn)大的偏差和漏洞，有利于研究目標的順利實現(xiàn)。
作者：吳立利a 謝英華b 柳偉偉c 工作單位：軍事醫(yī)學科學院a.科技部 b.生物工程研究所 c.研究生部
