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摘要:據(jù)統(tǒng)計(jì),目前約有46%~64%的糖尿病患者罹患糖尿病性角膜病變。隨著糖尿病患病率的日益攀升,糖尿病性角膜病變逐漸受到眼科醫(yī)生的重視,但其發(fā)病機(jī)制尚未明確。氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)活性氧和活性氮產(chǎn)生過多,從而損害機(jī)體組織細(xì)胞的一種病理過程,其參與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展,在糖尿病眼部并發(fā)癥中亦扮演重要角色。本文回顧氧化應(yīng)激在糖尿病性角膜病變發(fā)病機(jī)制以及治療中的研究進(jìn)展,希望對臨床診療有所助益。
關(guān)鍵詞:糖尿病性角膜病變;氧化應(yīng)激;發(fā)病機(jī)制;研究進(jìn)展
0引言
根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)的最新統(tǒng)計(jì),全球現(xiàn)有約4.64億糖尿病(diabetesmellitus,DM)患者,患病人數(shù)約占全球成年人口的9.3%,其中中國約有1.164億患者,數(shù)量位居世界第一[1]。以糖尿病視網(wǎng)膜病變、并發(fā)性白內(nèi)障、糖尿病性角膜病變(diabetickeratopathy,DK)為代表的DM眼部并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者視力,降低患者生活水平,是眼科醫(yī)生一直較為關(guān)注的領(lǐng)域。氧化應(yīng)激(oxidativestress,OS)是指細(xì)胞內(nèi)促氧化和抗氧化平衡失調(diào),導(dǎo)致氧化作用增強(qiáng)的一種氧化還原狀態(tài),它參與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展。OS在DM眼部并發(fā)癥的作用既往已有較多研究,但主要集中在糖尿病視網(wǎng)膜病變,隨著DK發(fā)病率上升日益受到重視,OS反應(yīng)在DK中的作用愈顯重要,本文對此項(xiàng)研究進(jìn)行綜述。
1DK的病理表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制
DK一般表現(xiàn)為眼部外傷或術(shù)后持續(xù)性角膜上皮缺損、愈合延遲、淺層點(diǎn)狀角膜炎,逐步發(fā)展為角膜潰瘍[2],而這些體征均源于高糖對角膜各層組織細(xì)胞的損害。其病理表現(xiàn)主要包括[3-4]:(1)上皮細(xì)胞增殖和遷移受到影響,細(xì)胞間的黏附下降;(2)上皮基底膜增厚,其間的半橋粒數(shù)目減少伴有晚期糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycationendproducts,AGEs)的沉積;(3)角膜基質(zhì)中的錨原纖維組織減少,導(dǎo)致其與基底膜之間的連結(jié)變松;(4)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度降低,形態(tài)異常;(5)角膜基底神經(jīng)叢纖維長度變短、纖維密度以及分支數(shù)量均減少。DK的發(fā)病機(jī)制主要包括三大類:(1)糖基化終末產(chǎn)物的沉積;(2)有關(guān)上皮修復(fù)信號(hào)通路活化的抑制;(3)氧化應(yīng)激反應(yīng)。這三類分子機(jī)制并非獨(dú)立參與DK的發(fā)生,而是共同作用進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、激發(fā)炎癥反應(yīng),最終損害角膜。
2OS與DM
OS是指活性氧(reactiveoxygenspecices,ROS)和活性氮(reactivenitrogenspecices,RNS)的產(chǎn)生與機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的清除相失衡,造成ROS和RNS過多,進(jìn)而對機(jī)體組織細(xì)胞產(chǎn)生損害。有研究證明[5]免疫細(xì)胞在病原體防御中發(fā)揮吞噬作用時(shí),ROS起著至關(guān)重要的作用,這說明輕度OS對機(jī)體新陳代謝有積極影響,產(chǎn)生了一定的保護(hù)作用。然而ROS、RNS的產(chǎn)生與機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的清除平衡一旦被打破,過量的ROS不僅會(huì)損傷組織細(xì)胞的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子,還會(huì)引起機(jī)體代謝途徑異常,導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生。既往研究表明[6-7],OS與癌癥、帕金森病、阿爾茨海默癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),同時(shí)也在DM相關(guān)并發(fā)癥中起重要作用。DM患者血液中持續(xù)的高血糖水平會(huì)通過增加線粒體氧耗量損傷線粒體功能,導(dǎo)致線粒體功能障礙,還因激活NADH/NADPH氧化酶從而上調(diào)ROS水平,同時(shí)增強(qiáng)一氧化氮合酶(NOS)活性導(dǎo)致一氧化碳(NO)合成增加以及抗氧化劑(例如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和多種維生素)表達(dá)降低,進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體組織細(xì)胞氧化還原狀態(tài)失衡[8-11]。
3OS與DK
DK的發(fā)病是一個(gè)復(fù)雜的過程,而OS貫穿其中。慢性的高糖狀態(tài)會(huì)從多個(gè)方面影響角膜組織細(xì)胞包括角膜神經(jīng)的正常生理狀態(tài)。例如AGEs的沉積、炎性反應(yīng)激活、線粒體功能障礙等,然而這多個(gè)途徑最終匯集于一點(diǎn)及ROS/RNS的增多及OS反應(yīng),OS會(huì)引起脂質(zhì)過氧化、蛋白修飾、DNA損傷進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死、角膜神經(jīng)節(jié)段性脫髓鞘、軸突變性、角膜神經(jīng)功能障礙最終引起DK[12]。下文將分述OS如何與DK發(fā)病機(jī)制中的各重要物質(zhì)相互作用。
3.1OS與AGEs
在DK中的相互作用AGEs是一組在蛋白質(zhì)、脂肪酸或核酸的氨基基團(tuán)與還原糖的醛基之間發(fā)生非酶性糖基化反應(yīng)(又稱Maillard反應(yīng))所形成的一系列具有高度活性終產(chǎn)物的總稱,其結(jié)構(gòu)具有高度異質(zhì)性,最早由Maillard于1912年發(fā)現(xiàn)[13]。糖尿病患者在長期高糖狀態(tài)下體內(nèi)合成過量AGEs蓄積在角膜各層,通過與糖基化終末受體(receptorforadvancedglycationendproducts,RAEG)的相互作用激活NADPH氧化酶,導(dǎo)致氧自由基的形成影響下游多條代謝通路,同時(shí)過量的ROS產(chǎn)生誘導(dǎo)RAGE表達(dá),從而啟動(dòng)正反饋循環(huán),加劇氧化應(yīng)激和炎癥的惡性循環(huán)[14]。AGEs與RAGE結(jié)合還導(dǎo)致MAPK、JAK/STAT等信號(hào)通路的激活,增加單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1,MCP-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor,TNF-α)和血管細(xì)胞黏附分子-1(vascularcelladhesionmolecule-1,VCAM-1)的表達(dá),引起炎性反應(yīng)。RAGE的激活也可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[15-17]。有研究表明,通過抑制AGEs可以降低OS反應(yīng),對組織起到保護(hù)作用。Kim等[18]團(tuán)隊(duì)將一種四味草藥提取物制成的藥物KIOM-79通過口服用于2型糖尿病大鼠模型,13wk后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠角膜厚度和細(xì)胞凋亡程度明顯低于對照組,且各層角膜組織AGEs的積累減少。此外,通過對相關(guān)標(biāo)記物的檢測,其團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)KIOM-79減弱了角膜中的氧化性DNA損傷、NF-κB激活和Bax過表達(dá),說明其通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對角膜起到了保護(hù)性作用。大量報(bào)道顯示[19],許多類型的天然化合物,如多酚、多糖、萜類、維生素和生物堿,都是抑制AGEs形成的良好候選者。這些化合物通過清除自由基、螯合金屬離子、捕獲活性羰基化合物、覆蓋蛋白質(zhì)的糖化位點(diǎn)和降低血糖水平來阻止AGEs的形成。
3.2OS與沉默信息調(diào)節(jié)因子
1在DK間的相互作用沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是一種具有代表性的組蛋白脫乙酰酶,作為Sirtuin蛋白家族的一員,其酶活性依賴于NAD+作為輔助因子。SIRT1通過組蛋白修飾控制基因表達(dá)、DNA修復(fù)、代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體功能等來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)[20]。SIRT1調(diào)控氧化應(yīng)激的機(jī)制主要包括:(1)通過去乙?;せ钸^氧化物增殖子激活-受體因子γ輔激活因子(peroxisomeproliferator-activatedreceptorcoactivator-1,PGC-1α)的基因轉(zhuǎn)錄,并通過調(diào)節(jié)核受體過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)、核呼吸因子(NRF)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)等基因的轉(zhuǎn)錄,參與調(diào)節(jié)線粒體功能[21]以及葡萄糖和脂質(zhì)的代謝[22]。(2)SIRT1調(diào)節(jié)抗氧化劑如超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶的表達(dá)[23]。此外,由于線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,SIRT1可以通過介導(dǎo)PGC-1α的乙酰化直接調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程[24]。SIRT1還通過調(diào)控NF-κBp65的乙酰化水平控制炎癥反應(yīng),同時(shí)調(diào)控炎癥因子相關(guān)基因的表達(dá):如白細(xì)胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-8、IL-6等[21-22,25]。近年來,關(guān)于SIRT1對DK作用機(jī)制的研究逐漸增多,且OS是不可或缺的一環(huán)。Wei等[26]研究發(fā)現(xiàn)在1型DM小鼠模型中,SIRT1的下調(diào)可促進(jìn)ROS的產(chǎn)生、抑制角膜上皮細(xì)胞活性促進(jìn)細(xì)胞凋亡,可望通過調(diào)節(jié)SIRT1的表達(dá)影響細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而起到對DK的保護(hù)作用;Liu等[27]通過建立DM相關(guān)干眼小鼠模型觀察到相對于普通干眼對照組,OS反應(yīng)顯著增強(qiáng)伴SIRT1表達(dá)下降;Li等[28]發(fā)現(xiàn)NAD+含量和NAMPT表達(dá)在1型DM小鼠和2型DM患者中均下降,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明體外補(bǔ)充NAD+可恢復(fù)角膜上皮細(xì)胞增殖和遷移的能力,此外,在DM小鼠中,NAD+及其前體煙酰胺單核苷酸(nicotinamidemononucleotide,NMN)和煙酰胺核糖苷(nicotinamideriboside,NR)也促進(jìn)角膜上皮和神經(jīng)再生,同時(shí)還伴有SIRT1、磷酸化的上皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)以及AKT和ERK1/2的表達(dá)增加。
3.3OS與炎性反應(yīng)在DK中的相互作用
炎癥是機(jī)體對病原體入侵、組織損傷和刺激物等各種病理過程的重要生理反應(yīng)。慢性炎癥主要通過自由基的持續(xù)和過量產(chǎn)生以及抗氧化劑的消耗導(dǎo)致細(xì)胞損傷[29]。ROS可以刺激核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子,增加促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。因此,有理由認(rèn)為靶向氧化應(yīng)激-炎癥細(xì)胞因子信號(hào)通路可能是治療糖尿病并發(fā)癥的潛在策略[30]。人高遷移率族蛋白B1(high-mobilitygroupbox1protein,HMGB1)是一種在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用的非組蛋白核蛋白[31],HMGB1是介導(dǎo)糖尿病并發(fā)癥一關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)。它通過與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptorforadvancedglycationendproducts,RAGE)、Toll樣受體(TLR2和TLR4)結(jié)合激活NF-κB,進(jìn)而導(dǎo)致促炎因子、黏附分子和血管生成因子的上調(diào)。Hou等[32]研究表明,HMGB1及其相關(guān)受體與DK的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示RAGE和TLR4(HMGB1受體)以及HMGB1相關(guān)信號(hào)通路也可能參與糖尿病角膜傷口和神經(jīng)愈合。促炎性HMGB1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要通過其兩個(gè)受體TLR和RAGE進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo),最終增加NF-κB的活化和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,包括TNF-α,IL-1β和IL-6。NF-κB的激活和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生反過來又可以誘導(dǎo)HMGB1及其受體的表達(dá),從而導(dǎo)致過度和持續(xù)的炎癥反應(yīng)正反饋循環(huán)。給予外源性HMGB1肽可以明顯抑制糖尿病眼損傷后角膜上皮/角膜神經(jīng)的恢復(fù),而甘草酸二鉀(dipotassiumglycyrrhizinate,DG)(HMGB1抑制劑)治療可以顯著加速這種恢復(fù)過程。HMGB1的兩個(gè)受體RAGE和TLR4也被發(fā)現(xiàn)參與糖尿病患者角膜上皮/角膜神經(jīng)愈合過程。這些結(jié)果表明HMGB1信號(hào)通路在DK的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,有望通過對HMGB1的抑制調(diào)控炎癥反應(yīng)進(jìn)而治療DK并促進(jìn)角膜神經(jīng)修復(fù)。
3.4OS與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
在DK中的相互作用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是一種專職于蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸?shù)募?xì)胞器,對細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞外刺激的變化高度敏感。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmicreticulumstress,ERS)主要是由ROS積累、毒性物質(zhì)、基因突變等引起應(yīng)激反應(yīng),其應(yīng)激原主要來自細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境改變,包括蛋白錯(cuò)誤折疊、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、未折疊蛋白聚集等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂[33]。研究發(fā)現(xiàn)ERS和OS存在相互作用:OS可誘導(dǎo)ERS,相反ERS也可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS生成。正常狀態(tài)下,細(xì)胞內(nèi)部分ROS來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化蛋白折疊過程中二硫鍵的形成,該過程中蛋白二硫化異構(gòu)酶(proteindisulphideisomerase,PDI)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化酶1α(endoplasmicreticulumoxidase,ERO1α)轉(zhuǎn)移電子給分子氧,相繼生成了副產(chǎn)物過氧化氫[34]。高糖狀態(tài)可誘發(fā)ERS,上調(diào)的PDI和ERO1α可導(dǎo)致大量過氧化氫形成,同時(shí)細(xì)胞代償功能有限,生成的還原性谷胱甘肽不足以中和超量的過氧化氫,繼而引起OS損傷。伴隨著細(xì)胞內(nèi)線粒體裂解和鈣超載,ERO1α介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放,亦可引起線粒體超氧化物的生成[35-36]。Wang等[37]的研究發(fā)現(xiàn),中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(MANF)在小鼠和人的角膜廣泛存在,其促進(jìn)糖尿病患者角膜上皮修復(fù)和神經(jīng)再生。主要機(jī)制是通過調(diào)控Akt信號(hào)通路抑制了高糖環(huán)境所致的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,MANF有望在改善DK患者角膜上皮延遲愈合和神經(jīng)損傷再生中扮演重要角色。
4DK氧化應(yīng)激的治療
4.1甘草酸
甘草酸(glycyrrhizin,GLY)是一種從甘草根中提取的皂苷類物質(zhì),具有抗炎等多種藥理作用,其已被證明對敗血癥、結(jié)腸炎腦損傷、角膜炎的動(dòng)物模型有效[38-40],在臨床上已被用于治療慢性肝炎患者。Somayajulu等[41]將GLY作用于高糖培養(yǎng)的小鼠角膜上皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其具有一定的保護(hù)作用,且降低了促炎癥反應(yīng)和OS標(biāo)志物如HMGB1、IL-1b、TLR2、TLR4、NOD樣受體蛋白3炎癥小體(NOD-,LRR-andpyrindomain-containingprotein3,NLRP3)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase2,COX2)、超氧化物歧化酶-2(superoxidedismutase2,SOD2)血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)、谷胱甘肽過氧化酶2(glutathioneperoxidase2,GPX2)的表達(dá)量。另外該團(tuán)隊(duì)在糖尿病小鼠模型的飲水中給予GLY,發(fā)現(xiàn)與對照組相比除了上述標(biāo)志物,C-X-C型趨化因子配體2(C-X-Cmotifchemokineligand2,CXCL2)和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)表達(dá)也下降,這進(jìn)一步說明GLY對高糖所致的OS具有保護(hù)作用。
4.2色素上皮衍生因子
色素上皮衍生因子(PEDF)主要由視網(wǎng)膜色素上皮合成,是一種50kDa的分泌蛋白,屬于非抑制性絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一員[42]。它也存在于角膜、結(jié)膜和睫狀體上皮細(xì)胞、穆勒神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[43]。大量研究證明PEDF可以降低RAGE的表達(dá)并發(fā)揮抗氧化作用,Liu等[44]選取6周齡小鼠注射STZ建立1型DM小鼠模型,并給予50nmol/L量的PEDF滴眼每日3次,持續(xù)8wk后發(fā)現(xiàn)與給予人工淚液的DM對照組小鼠對比,其角膜上皮染色評分降低且淚液分泌量和角膜敏感性均有顯著提高。進(jìn)一步對小鼠角膜行組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)PEDF可減少DM小鼠角膜中ROS的累積、降低RAGE的表達(dá)以及增加抗氧化劑SOD1的表達(dá),說明PEDF對DM所致的眼表損傷具有保護(hù)作用。
4.3α-硫辛酸
α-硫辛酸(alpha-lipoicacid,ALA)是一種天然存在的低分子量(206.32g/mol)二硫醇微量營養(yǎng)素,作為與線粒體代謝相關(guān)的生物能酶活性的輔助因子,它參與體內(nèi)的物質(zhì)代謝中的?;D(zhuǎn)移,能消除導(dǎo)致加速老化與致病的自由基。ALA的潛在抗氧化作用可歸因于直接活性氧(ROS)清除能力、金屬離子螯合能力和恢復(fù)細(xì)胞抗氧化劑的能力,如還原谷胱甘肽(GSH)、輔酶Q、維生素C和E水平。研究證明[45-47]ALA具有抗氧化的生物活性,對心血管疾病、炎癥、衰老和阿爾茨海默病認(rèn)知功能障礙具有保護(hù)作用,因而其藥理機(jī)制受到關(guān)注。另外關(guān)于ALA的大多數(shù)臨床研究顯示了其在減輕DM患者的OS、神經(jīng)病變和神經(jīng)病變相關(guān)疼痛和感覺異常方面也具有較強(qiáng)潛力[48]。
5展望
OS參與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展,其重要性體現(xiàn)在連接包括異常代謝、炎癥反應(yīng)以及ERS等多種發(fā)病機(jī)制。目前OS在DM眼部并發(fā)癥的研究主要集中在糖尿病視網(wǎng)膜病變,在DK中的研究尚有不足,且多局限于角膜上皮損傷修復(fù),未來OS在DK的發(fā)病機(jī)制中的作用有待進(jìn)一步研究。
作者:黃鈺清 楊燕寧 單位:武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心