食品微生物實驗室質(zhì)量控制實踐

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質(zhì)量控制是實驗室檢測工作的重要環(huán)節(jié)，其在微生物檢測過程中顯得尤為重要。實驗室操作人員在日常工作中除了要嚴(yán)格遵守相關(guān)的管理制度和規(guī)范化的操作流程外，更應(yīng)對影響實驗室檢測的重要因素及環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格的控制和管理。本文以實際經(jīng)驗為依據(jù)，主要從人員管理、設(shè)備管理、培養(yǎng)基管理、關(guān)鍵耗材控制、標(biāo)準(zhǔn)菌株及環(huán)境監(jiān)控等方面對食品微生物實驗室的質(zhì)量控制措施進(jìn)行研究和實踐，并總結(jié)出關(guān)鍵注意事項。

1人員管理

1.1人員能力要求

實驗室人員主要分為管理人員、技術(shù)人員、技術(shù)支持人員等，相應(yīng)崗位的人員應(yīng)具備相應(yīng)的技術(shù)能力，以及相應(yīng)的技術(shù)能力證明（證書或證件）。微生物檢驗室應(yīng)由具備相應(yīng)技術(shù)能力的人員負(fù)責(zé)室內(nèi)的技術(shù)工作，并設(shè)立質(zhì)量監(jiān)督員。檢測人員的水平直接關(guān)系和影響實驗室的檢驗?zāi)芰Γ虼?，檢驗人員必須具備較強(qiáng)的技術(shù)能力和責(zé)任心。食品微生物檢驗人員應(yīng)具備一定的微生物檢驗資質(zhì)或相關(guān)專業(yè)素養(yǎng),即能正確實施檢驗操作并對結(jié)果進(jìn)行判讀。其中，有視覺障礙的人員不能執(zhí)行涉及辨色的實驗工作，因為微生物檢測中的許多生化試驗等需要根據(jù)顏色進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2培訓(xùn)與考核

實驗室管理層應(yīng)保證所有人員都接受過必要的培訓(xùn)，包括微生物檢測技能方面的培訓(xùn)、實驗室生物安全方面的培訓(xùn)、設(shè)備操作維護(hù)方面的培訓(xùn)等，從而保證相關(guān)人員能熟練準(zhǔn)確的操作及掌握消毒知識和生物安全操作，避免人為污染樣品的同時有效保證自身安全。除此之外，還應(yīng)制定關(guān)于檢測人員的繼續(xù)教育培訓(xùn)計劃，配套進(jìn)行適當(dāng)?shù)目己擞媱潱赐ㄟ^人員比對、內(nèi)部比對、盲樣考核、使用購買的質(zhì)控樣品等方式對人員技術(shù)能力等進(jìn)行考核，以保證檢驗人員技術(shù)水平和各方面素質(zhì)的持續(xù)有效提高。

2設(shè)備管理

2.1微生物實驗室主要設(shè)備

實驗室的設(shè)備是質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，也是實驗室檢測數(shù)值準(zhǔn)確性的保證，故實驗室應(yīng)配備滿足工作要求的檢測設(shè)備。微生物實驗室常用的儀器設(shè)備包括高壓滅菌器、生物安全柜、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、水浴鍋、冰箱、顯微鏡等必備設(shè)備，以及微生物測定儀器、微生物檢定儀器、空氣采樣器、酶標(biāo)儀、PCR儀等專用設(shè)備。

2.2設(shè)備的要求和管理

檢測設(shè)備的存放、使用、維護(hù)、保養(yǎng)等管理應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定程序進(jìn)行，并定期做好檢定/校準(zhǔn)及期間核查以保證其性能滿足檢驗要求。為了避免微生物實驗室中出現(xiàn)交叉感染的情況，儀器設(shè)備盡量不要頻繁移動，若必須移動或維修，應(yīng)在移動或維修后進(jìn)行檢定/校準(zhǔn)或核查其性能是否可以滿足工作需要后再使用。儀器設(shè)備使用過程中應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)控，如發(fā)現(xiàn)異?；蚬收?，應(yīng)立即停止使用并核查是否已對之前的檢測結(jié)果造成影響。使用自動化設(shè)備進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、處理、存儲等，應(yīng)防止數(shù)據(jù)被篡改或破壞的風(fēng)險，并防止非授權(quán)人員使用。此外，實驗室所使用的高壓滅菌器若為特種設(shè)備，檢測人員則要具備特種設(shè)備操作證書方可進(jìn)行操作。日常監(jiān)控可定期使用滅菌膠帶、滅菌指示卡及生物指示物監(jiān)控高壓滅菌器的滅菌效果，并定期核查壓力表和安全閥的性能。如果是溫度對檢測結(jié)果有重要影響的設(shè)備，如培養(yǎng)箱、水浴鍋、冰箱等，要通過校準(zhǔn)正確的引入校正因子，并定期監(jiān)控設(shè)備的溫度變化。生物安全柜、超凈臺需要定期核查過濾系統(tǒng)、風(fēng)速等指標(biāo)性能是否滿足檢驗要求。

3培養(yǎng)基管理

3.1培養(yǎng)基的采購與驗收

實驗室購買和使用培養(yǎng)基時要嚴(yán)格依照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB4789.28-2013）進(jìn)行驗證，可選擇國內(nèi)外知名大品牌且質(zhì)量和信譽(yù)度較好的廠商購進(jìn)，并向供應(yīng)商索要驗收合格報告及廠家資質(zhì)證明等。按照GB4789.28-2013的要求使用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行選擇性、生長率、特異性等技術(shù)驗收。培養(yǎng)基開啟后要記錄啟用日期，并按說明書的要求條件進(jìn)行存放，因為有些培養(yǎng)基開啟后需要冷藏保存，如SC培養(yǎng)基。

3.2培養(yǎng)基配制和使用注意事項

正確制備培養(yǎng)基是微生物檢驗的基礎(chǔ)工作之一。培養(yǎng)基在配制稱量時，為防止吸入含有有毒物質(zhì)的培養(yǎng)基粉末，操作人員應(yīng)佩戴口罩或在通風(fēng)柜中進(jìn)行。將配置好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，其分裝量需按要求進(jìn)行分裝，不得超過容器的2/3，避免滅菌時溢出。包扎滅菌時，盛裝培養(yǎng)基容器的塞子必須塞緊，以免因塞子松動或脫落而造成污染。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)按說明書的要求進(jìn)行滅菌，包括煮沸滅菌、濕熱滅菌、過濾除菌等方法，具體按檢驗標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定進(jìn)行滅菌。脫水培養(yǎng)基在分裝或滅菌前均應(yīng)完全溶解于水中。由于所有的培養(yǎng)基或多或少都對熱具有一定的敏感性，因此培養(yǎng)基在加熱助溶時切忌過度加熱，否則會使培養(yǎng)基的顏色變深，甚至影響培養(yǎng)基的質(zhì)量。滅菌效果的控制是微生物檢驗者面臨的關(guān)鍵問題之一，故應(yīng)對滅菌的效果進(jìn)行驗證——通常采用滅菌指示膠帶或嗜熱脂肪芽孢桿菌進(jìn)行，驗證時需按各自說明書的要求進(jìn)行操作。固體培養(yǎng)基滅菌后再融化，可使用微波爐或流體蒸汽進(jìn)行，且只允許融化一次。融化后的培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用，放置時間一般不超過4h，未用完的培養(yǎng)基不能重新凝固留待下次使用。此外，商品化的即用型培養(yǎng)基應(yīng)按照廠商提供的說明書指示進(jìn)行使用和存放，超過有效期的培養(yǎng)基不得使用。

4關(guān)鍵耗材管理

關(guān)鍵耗材一般指會對檢測結(jié)果造成影響的試劑耗材。食品微生物實驗室常用的關(guān)鍵耗材主要包括無菌培養(yǎng)皿、無菌吸管或吸頭、涂布棒、接種環(huán)、接種針等。對于關(guān)鍵試劑耗材，應(yīng)選擇資質(zhì)滿足要求的供應(yīng)商進(jìn)行采購，且要對其進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。

4.1關(guān)鍵耗材的符合性檢驗

符合性檢驗通常指感官檢驗，即收到耗材后仔細(xì)核查耗材的供應(yīng)商、生產(chǎn)單位、產(chǎn)品名稱、規(guī)格/型號、數(shù)量、生產(chǎn)日期、生產(chǎn)批號、滅菌日期、有效期等信息，并檢查耗材包裝是否完整。

4.2關(guān)鍵耗材的技術(shù)性檢驗

短棒狀一次性無菌消耗材料（包括無菌采樣棉簽、接種環(huán)、接種針等）：直接將正常使用端插入10mL溴甲酚紫葡萄糖肉湯大試管中，滅菌剪刀剪去手部接觸過的部分，塞緊試管塞。長棒狀一次性無菌消耗材料（包括移液管等）：直接將正常使用端插入10mL溴甲酚紫葡萄糖肉湯大試管中，在漩渦混合儀上振蕩1min或乳膠洗耳球吹吸10次，棄去測試材料，塞緊試管塞。容器型一次性無菌消耗材料（包括菌種保存管、拍擊式均質(zhì)袋等）：直接將溴甲酚紫葡萄糖肉湯注入待測試的容器中，液面高度不低于容器高度的2/3，并用無菌材料封閉容器口。扁平型一次性無菌消耗材料（包括塑料平皿等）：在無菌條件下直接將待測試材料放入適當(dāng)?shù)臒o菌容器（如拍擊式均質(zhì)袋）中，注入適量溴甲酚紫葡萄糖肉湯，液面高度應(yīng)保證將全部待測試物淹沒，折疊塑料袋口或包扎瓶口即可。將上述處理后的檢樣置于生化培養(yǎng)箱中，36±1℃培養(yǎng)5d，進(jìn)行觀察并結(jié)果判定。逐一觀察溴甲酚紫葡萄糖肉湯是否出現(xiàn)變色、渾濁、沉淀、絮狀、菌膜、產(chǎn)氣等情況。此外，有時微生物增殖后可聚集成團(tuán)使其沉積在容器底部，發(fā)生這種情況時，應(yīng)小心振蕩容器后再進(jìn)行觀察。如溴甲酚紫葡萄糖肉湯呈紫色清亮透明狀態(tài)，則判定為符合無菌試驗的要求。

5標(biāo)準(zhǔn)菌株管理

標(biāo)準(zhǔn)菌株的質(zhì)量管理是微生物實驗室質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)之一，其應(yīng)是從標(biāo)準(zhǔn)菌株保藏中心獲得的真空保存菌株，或至少定義到屬或種水平的菌株。標(biāo)準(zhǔn)菌株的來源已知，形態(tài)、染色、生化和血清學(xué)特征典型，性能穩(wěn)定，鑒定結(jié)果重復(fù)性好，極少發(fā)生變異。

5.1標(biāo)準(zhǔn)菌株的采購與驗收

標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)從合格的供應(yīng)商處購買，其編號應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)/檢測方法的要求相一致，并帶有證書。實驗室收到標(biāo)準(zhǔn)菌株后，首先應(yīng)進(jìn)行符合性檢驗，并記錄菌株編號和來源途徑信息，確保溯源性清晰。同時，還需要記錄標(biāo)準(zhǔn)菌株的名稱、數(shù)量、生產(chǎn)日期、接收日期和有無破損等情況。

5.2標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活、確認(rèn)、傳代

5.2.1標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，并根據(jù)生產(chǎn)商提供的說明書或有關(guān)技術(shù)通則進(jìn)行復(fù)活。菌種的首次活化最好是在非選擇性瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行，除非特殊情況或特別推薦，一般不使用液體培養(yǎng)基。

5.2.2標(biāo)準(zhǔn)菌株的確認(rèn)用無菌接種環(huán)取出菌株培養(yǎng)物，在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板或鑒別平板上劃線分離出單個菌落，然后在一定的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時觀察平板上是否出現(xiàn)典型的菌落形態(tài)，并進(jìn)一步進(jìn)行生化及血清學(xué)等試驗，以確認(rèn)該菌株是否符合要求。對于符合要求的菌株進(jìn)行傳代和保存，并做好確認(rèn)記錄。對于不符合要求的菌株，則要及時滅菌銷毀并做好相關(guān)記錄。

5.2.3標(biāo)準(zhǔn)菌株的傳代《中國藥典》（2005年版）做出“菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌株保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0代）”的明確規(guī)定。因此，為保證菌株質(zhì)量，其傳代不應(yīng)超過5代。凍干菌株復(fù)活時的增菌培養(yǎng)物稱為第1代，接種于平板上得到單個純菌落稱為第2代——經(jīng)確認(rèn)后，挑選純菌落制成一定濃度的菌懸液于磁珠凍存管中，充分吸附后，再吸出菌液，密封凍存管并貼上標(biāo)簽，保存于-70~-80℃的超低溫冰箱內(nèi)，磁珠凍存保存的為第2代。挑取單個純菌落接種于斜面上作為工作菌株，一般保存于4℃的冰箱內(nèi)，選擇合適的條件進(jìn)行培養(yǎng)，此培養(yǎng)物為第3代。通常情況下，選擇第3代至第5代作為工作用菌株。冷凍菌種一旦解凍轉(zhuǎn)種制備為工作菌株后，不得重新冷凍和再次使用。

5.3標(biāo)準(zhǔn)菌株的銷毀

如果標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過確認(rèn)試驗證明已經(jīng)老化、退化、變異、污染等或該菌株已無使用需要時，應(yīng)及時進(jìn)行無害化處理。實驗室對菌株的領(lǐng)用、保存、傳代、確認(rèn)、銷毀方面應(yīng)形成完整的鏈條，避免菌株的丟失或混用。

6環(huán)境控制

微生物檢測工作具有其特殊性，因此對實驗室的環(huán)境條件要求尤為嚴(yán)格。實驗室的環(huán)境條件不應(yīng)對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響，且為保證人員安全，食品微生物實驗的設(shè)計與管理應(yīng)符合《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。同時，實驗室的設(shè)計應(yīng)符合單方向工作流程，避免交叉污染。同時，食品微生物的檢驗應(yīng)在潔凈區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。病原微生物的分離鑒定應(yīng)在生物安全二級及以上生物安全實驗室進(jìn)行；此外，實驗室如從事霉菌的檢測/鑒定，最好有獨立的霉菌室和獨立的霉菌培養(yǎng)箱，以避免孢子在空氣中擴(kuò)散而造成環(huán)境污染。潔凈室應(yīng)按照要求定期進(jìn)行清潔消毒，可采用紫外線滅菌、消毒劑噴灑，如75%酒精、84消毒液、季銨鹽類消毒液（新潔爾滅）等，并定期使用乳酸或高錳酸鉀進(jìn)行熏蒸。此外，還應(yīng)檢測潔凈度是否達(dá)標(biāo)，該評價的常用方法一般以沉降菌的計數(shù)為主，即將90mm的培養(yǎng)皿暴露30min進(jìn)行培養(yǎng)，百級潔凈室菌落總數(shù)≤1CFU，萬級潔凈室菌落總數(shù)≤3CFU，十萬級凈室菌落總數(shù)≤10CFU。

7小結(jié)

民以食為天，食以安為先。食品微生物的檢驗是守護(hù)食品安全工作的重中之重，進(jìn)行有效的質(zhì)量控制是保證實驗室檢測結(jié)果真實、準(zhǔn)確、可靠的重要環(huán)節(jié)。由于微生物檢驗的全過程十分繁瑣，影響因素眾多，因此在日常工作中要做好質(zhì)量控制，檢驗人員不僅要有專業(yè)的基礎(chǔ)知識和熟練的操作技能，還要有嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致、不怕麻煩的態(tài)度，并嚴(yán)格按照規(guī)定的程序進(jìn)行操作。如發(fā)現(xiàn)問題，需要多方位思考，尋找問題產(chǎn)生的根本原因，最終解決問題是微生物質(zhì)量控制的根本。

作者：付敏 陶文靖 趙婷婷 單位： 中農(nóng)孚德檢測技術(shù)有限公司